牛文玉，陳佑學(xué)

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外用傷科藥對運動性慢性骨骼肌損傷及肌細胞IL-6表達影響研究

牛文玉1，陳佑學(xué)2

1.銅仁學(xué)院體育與健康學(xué)院，貴州 銅仁554300;2.首都體育學(xué)院，北京 100191

摘要：目的：研究不同外用傷科藥對運動性骨骼肌慢性損傷中肌細胞IL-6表達的影響以及骨骼肌細胞中IL-6在運動性慢性肌組織損傷修復(fù)中所發(fā)揮的作用。方法：采用體重2.2kg—2.5kg成年雄性新西蘭兔42只，隨機分為對照組、扶他林組、消痛貼組，每組21只。其中每組又分為4、5周組，每組7只。動物采用高電壓低電流刺激儀刺激，使其產(chǎn)生主動的跑跳運動，訓(xùn)練方案：0.1-0.2s/次(每兩次間隔12s),20min/組(兩組間歇20min)，3組/天，5天/周。訓(xùn)練結(jié)束后分別給4周、5周扶他林組和消痛貼組以不同的外用藥。各組在相應(yīng)的訓(xùn)練周(4、5)完成后取左腿腓腸肌內(nèi)側(cè)頭，用4%多聚甲醛固定液保存，進行HE染色及免疫組織化學(xué)處理，光鏡觀察肌組織形態(tài)變化及細胞中IL-6表達的免疫組織化學(xué)圖像分析，計算IL-6平均光密度值。結(jié)果：1、隨著訓(xùn)練時間的推移，骨骼肌細胞IL-6的表達明顯增多；2、外用傷科藥可以降低運動性慢性骨骼肌損傷中細胞的炎癥因子；3、外用傷科藥可以顯著降低運動性慢性骨骼肌損傷中肌細胞IL-6的表達。結(jié)論：1、骨骼肌損傷中，肌細胞的炎性因子與肌細胞IL-6的表達存在一定的聯(lián)系；2、外用傷科藥對慢性骨骼肌損傷中肌細胞的修復(fù)有著較明顯的作用；3、運動性慢性骨骼肌損傷中，不同的外用傷科藥都可以顯著降低骨骼肌IL-6的表達影，二者沒有顯著差別。

關(guān)鍵詞：IL-6表達；外用貼藥；作用；運動性肌損傷

IL-6(白細胞介素-6)主要由T細胞、B細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、單核細胞和組織中巨噬細胞所分泌，能夠提高機體非特異性免疫功能，在炎癥反應(yīng)中起作用的細胞因子，多年來對于IL-6的研究一直在進行。近來很多研究發(fā)現(xiàn)，IL-6與運動以及運動引發(fā)的骨骼肌組織損傷存在密切的聯(lián)系[1-3]。運動量、運動項目、運動強度的不同可以引起血漿中IL-6的表達發(fā)生不同的變化。IL-6還可以能在一定程度上反映出骨骼肌組織微細結(jié)構(gòu)的變化，所以將其作為觀察骨骼肌損傷的一個評定指標[4]。

外用消痛貼的主要成分是獨一味、水柏枝等中藥材。臨床多次證明，消痛貼在慢性軟組織損傷的治療中有著較為明顯的作用[5-7]。扶他林軟膏的主要組成是雙氯芬酸納,屬非甾體類抗炎類藥物,有研究證實外用扶他林膏對于炎癥的減輕有著明顯的作用。因此，探討二者在運動性骨骼肌慢性損傷中與肌細胞IL-6之間的相互作用和關(guān)系，為IL-6新的應(yīng)用做基礎(chǔ)性的理論建設(shè)。

1材料與方法

1.1實驗對象和分組

實驗對象為體重在2.2kg—2.5kg間成年雄性新西蘭兔42只，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，實驗動物許可證號：SCKK2009-0005,在中國中醫(yī)科學(xué)研究院基礎(chǔ)理論研究所實驗動物中心，按照國家標準的兔飼養(yǎng)常規(guī)分籠飼養(yǎng)。所有動物隨機分為對照組(n=21)、外用扶他林組(n=21)和外用消痛貼組(n=21),其中每組分別為4、5周組，分組如下：

表1　具體分組情況

1.2運動方案

動物的訓(xùn)練在中國中醫(yī)科學(xué)研究院中醫(yī)理論研究所動物房進行，依據(jù)有關(guān)研究運動性骨骼肌損傷的造模方法以及有關(guān)文獻和預(yù)實驗確定運動方案，采用高壓低流電刺激儀刺激實驗組動物，使其產(chǎn)生跑跳運動，具體方案如下：

每只動物每隔12秒刺激一次，每次刺激時間持續(xù)0.1-0.2秒，每天訓(xùn)練60分鐘，分3次進行，兩次訓(xùn)練間隔20分鐘。每只兔子每天跑跳約300次，每周連續(xù)訓(xùn)練5天，每天的訓(xùn)練的開始時間不變。在訓(xùn)練過程中觀察記錄動物每天的精神狀態(tài)、體重變化、進食情況，檢查是否受傷等。

1.3給藥

將外用消痛貼組和扶他林組中4、5周組動物小腿部位毛發(fā)剔除，將消痛貼和扶他林軟膏均勻涂抹于該皮膚處，并用紗布纏裹。給藥在每天訓(xùn)練結(jié)束后進行，每日一次，下次訓(xùn)練前將藥包拆除。

1.4取材

分別在第4、5周訓(xùn)練結(jié)束后，使用空氣栓塞法處死動物后立刻取動物左腿腓腸肌內(nèi)測頭，分兩塊置入4%多聚甲醛固定液中進行固定。

1.5肌組織HE染色、觀察

將所取標本分別進行常規(guī)HE染色處理，并在光鏡下觀察肌細胞、肌細胞核、肌內(nèi)衣、肌外衣、炎癥細胞等，采用奧林巴斯數(shù)碼顯微鏡進行拍照。

1.6免疫組化標本制作及圖像分析

制作免疫組標本，并采用奧林巴斯D3.2圖像處理軟件對片子圖像進行采集，在判定肌細胞IL-6的表達中：棕褐色的區(qū)域為表達區(qū)，密度的深度、面積與IL-6的表達量呈正相關(guān)；

1.7數(shù)據(jù)處理

隨機取免疫組化圖像5個不同的視野記錄，使用MIAS4.0對所采圖像進行分析(平均光密度值)，得出組織圖片IL-6表達的平均光密度值。采用SPSS17.0軟件對所結(jié)果進行處理，用均值±標準差(X±s)表示。不同用藥組間橫向比較采用單因素方差分析法進行(a=0.05)。

2結(jié)果

2.1肌細胞形態(tài)學(xué)比較(光學(xué)鏡)

2.1.1橫向比較4周組

4周對照組：細胞間結(jié)締組織增生，細胞染色不均，出現(xiàn)紅染，細胞核腫脹，巨噬細胞進出現(xiàn)在壞死、變性或結(jié)構(gòu)被破壞的肌細胞中(圖1)。

圖2　( HE,橫切,400倍鏡)

圖3　(HE,橫切,400倍鏡)

4周扶他林組：呈現(xiàn)單相多灶性炎性細胞浸潤，核固縮明顯，細胞排列較為整齊，染色不均，有顆粒性變性(圖2)。4周消痛貼組：有較少的炎性細胞，未見明顯的炎性細胞浸潤灶，細胞排列較為整齊、致密，染色均勻(圖3)。

2.1.2橫向比較5周組

圖4　(HE,橫切,400倍鏡)

圖5　(HE,橫切,400倍鏡)

圖6　(HE,橫切,400倍鏡)

5周對照組：出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤灶，細胞核腫脹，細胞間隙開始變得模糊不清，細胞腫脹呈現(xiàn)圓形，炎性細胞侵入壞死細胞內(nèi)，細胞內(nèi)出現(xiàn)的免疫細胞，細胞變性壞死，結(jié)夠不完整(圖4)。相比之下，5周消痛貼、扶他林組有較少的炎性細胞，未見明顯的炎性細胞浸潤灶，細胞排列較為整齊、致密，染色均勻(圖5、6)。

2.2骨骼肌細胞IL-6免疫組織化學(xué)圖像分析

2.2.1縱向比較4、5周對照組中不同用藥組肌細胞IL-6平均光密度值的變化

表1　4、5周對照組IL-6平均光密度值橫向比較

*:與4周照組比較P<0.05

研究結(jié)果顯示，與4周對照組比較5周對照組肌細胞IL-6平均光密度值顯著升高(p<0.05)。隨著訓(xùn)練時間的推移，骨骼肌細胞IL-6的表達明顯增多。

2.2.2橫向比較4周組中不同用藥組肌細胞IL-6平均光密度值的變化

表2　4周各組IL-6平均光密度值橫向比較

*:與對照組比較P<0.05 #:與4周扶他林組比較P>0.05

研究結(jié)果顯示，與4周對照組相比較，4周扶他林組、消痛貼組肌細胞IL-6的平均光密度值較低，且存在顯著性差異(P<0.05)；與4周扶他林組相比較，4周消痛貼組的肌細胞IL-6平均光密度值無明顯差異(P>0.05)。不同外用傷科藥在以降低慢性骨骼肌損傷中肌細胞IL-6的表達有相同影響，都可以降低其表達。

2.2.3橫向比較5周各組肌細胞IL-6平均光密度值的變化

表3　5周各組IL-6平均光密度值橫向比較

*:與5周對照組比較P<0.01 #:與5周扶他林組比較P>0.05

與5周對照組相比較，5周扶他林組、消痛貼組肌細胞IL-6的平均光密度值較低，且存在顯著性差異(P<0.05)；與5周扶他林組相比較，5周消痛貼組肌細胞IL-6平均光密度值無明顯差異(P>0.05)。在運動性慢性骨骼損傷中，外用傷科藥對肌細胞IL-6的表達有降低作用。

3討論

3.1不同外用藥對骨骼肌形態(tài)學(xué)變化的影響

外用消痛貼主要的藥學(xué)是多種中藥成份組成，在消除、減輕局部炎癥反應(yīng)，促進受損組織修復(fù)方面有著明顯的作用。加之其所采用的藥貼技術(shù)，可以將藥物直接覆于受損肌組織，外用效果明顯。外用消痛貼外在急性軟組織損傷中有著明顯的作用，這與局部受損組織的炎癥反應(yīng)有關(guān)。扶他林軟膏的主要組成是雙氯芬酸納,屬非甾體類抗炎類藥物,有研究證實外用扶他林膏對于減輕細胞炎癥反應(yīng)有著明顯的作用。通過研究同表明，通過對比外用貼藥和外用扶他林發(fā)現(xiàn)二者有著相似的藥用價值。

運動性骨骼肌慢性損傷中，不同的外用藥對不同組別肌細胞有著較為明顯的影響。觀察對比用各對照組(4、5周)和各給藥組的肌組織切片，發(fā)現(xiàn)：與對照組相比較，扶他林組和消痛貼藥組都有著各自變化的特點。對照組可看到明顯的肌纖維壞死、變性，多發(fā)生變性，壞死，肌纖維異染，泡體溶解。從組織中可觀察到機化了的瘢痕組織，壞死肌細胞增多，大量巨噬細胞浸潤、侵入壞死肌細胞，提示肌細胞結(jié)構(gòu)受到破壞，受損程度較為嚴重。扶他林組和外用貼藥組炎性細胞較為減少。這與高楊等人的研究結(jié)果是相吻合的，外用消痛貼對于局部的炎癥有著抑制作用[5]。

3.2不同外用藥對運動性骨骼肌慢性損傷中肌細胞IL-6的表達影響

從縱向來看，5周對照組肌細胞IL-6的表達，明顯高于4周訓(xùn)練組，結(jié)合肌組織形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果可知，隨著訓(xùn)練時間的延長，骨骼肌細胞損傷中的炎癥在增多，同時肌細胞IL-6的表達也在增多。這也就是說運動性慢性骨骼肌細胞損傷中肌細胞IL-6的表達與肌細胞炎癥反應(yīng)存在一定的聯(lián)系。從不同用藥組橫向比較的結(jié)果來看，與對照組相比較，消痛貼組、扶他林組肌細胞IL-6的表達值有著顯著性差異。就說明在用藥2周后，扶他林組和消痛貼組相似的效果，都能夠降低肌細胞IL-6的表達水平。

扶他林軟膏的主要組成是雙氯芬酸納,屬非甾體類抗炎類藥物,有研究證實外用扶他林膏對于炎癥的減輕有著明顯的作用。消痛貼主要的藥學(xué)成分是獨一味等多種中藥成份，在消除、減輕局部炎癥反應(yīng)，促進受損組織將復(fù)有著明顯的作用。加之其所采用的要貼技術(shù)，可以將藥物直接覆于受損肌組織，外用效果明顯。臨床上外用消痛貼對各種急、慢性軟組織損傷都有著較為明顯的療效[8-10]。李敏、何朝永等2008年的研究中，以周istar大鼠作為實驗對象，采用自制撞擊器造成動物急性軟組織損傷，分別給以不同組別的動物不同的藥，通過對比外用消痛貼組和隨機模型對照組動物血漿中TNF-α、IL-1βmRNA表達水平后發(fā)現(xiàn)，外用消痛貼組動物血漿中TNF-α、IL-1βmRNA較隨機模型組低，進而得出：外用消痛貼治療急性軟組織損傷的機制可能是通過抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α表達來發(fā)揮其抗炎作用[11]。本研究通過光鏡觀察組織的形態(tài)學(xué)變化，可發(fā)現(xiàn)外用消痛貼對于運動性骨骼肌慢性損傷也有著較為明顯的療效。

在運動性骨骼肌慢性損傷中，IL-6在肌細胞中的表達機制還不甚明了，在運動性損傷中的作用也存在著較多的疑問。運動性骨骼肌損傷中，短期(2周)的外用傷科藥對于骨骼肌IL-6的表達有著影響，對運動性骨骼肌慢性損傷有著一定的療效。

4結(jié)論

(1)骨骼肌損傷中，肌細胞的炎性因子與肌細胞IL-6的表達存在一定的聯(lián)系；

(2)外用傷科藥對慢性骨骼肌損傷中肌細胞的修復(fù)有著較明顯的作用；

(3)運動性慢性骨骼肌損傷中，不同外用傷科藥(扶他林與消痛貼)都可以顯著降低骨骼肌IL-6的表達影，二者沒有顯著差別。

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第一作者簡介：牛文玉(1985-)，男，山西呂梁人，講師，碩士，研究方向：體育保健康復(fù)理論與應(yīng)用。

中圖分類號：

文獻標識碼：A

文章編號：1005-0256(2016)07-0147-4

doi:10.19379/j.cnki.issn.1005-0256.2016.07.060

Research on The Influence of External Applied Medicine to Exercise-Induced Chronic Skeletal Muscle Injuries and Muscle Cells IL-6 Expression

Niu Wenyu1,Chen Youxue2

Abstract:The thesis aims at discussing the influence of different external applied medicine to muscle cells IL-6 expression in exercise-induced chronic skeletal muscle injuries, as well as the role IL-6 played in exercise-induced skeletal muscleinjury rehabilitation. Methods: Randomly divide 42 adult male New Zealand rabbits weighted from 2.2kg to 2.5kg into 3 groups—control group,voltaren group and pain-relieving paste group, with 7 rabbits per group. And each group is divided into 4-week group and 5-week group. High voltage and low current stimulation is used to stimulate the rabbits to run and jump actively. Training schedule:0.1-0.2s per time with 12s intervals, 20min per set with 20min intervals between sets, 3 sets per day and 5 days a week. After training, use different medicine for voltaren group and pain-relieving paste group (both 4-week and 5-week groups) . Inside muscle heads of left leg gastrocnemius muscles are sampled when the training week finished, preservedin 4% paraformaldehyde and treated with HE dyeing and immunochemistry. Then the change of organelle’s tissue and immunochemical analysis on IL-6 image in cells are observed under light microscope to counts the IL-6average optical density value. Results are as follows：First, inflammatory factors are related with muscle sell IL-6 expression in skeletal muscle injuries. Second, external applied medicine is significantlyeffective for chronic skeletal muscle damage. Third, no significant differences between different external medicines in reducing skeletal sell IL-6 expression.

Key words:IL-6expression; external applied medicine; effect; exercise-induced muscle damage

College of Sport and Health, Tongren University, Tongren 554300, Guizhou,China.