李金艷，曾 敏,王秦川△

(重慶市中醫(yī)院:1．婦產(chǎn)科，2.病理科 400011)

VEGF在妊娠期糖尿病巨大兒胎盤及臍帶中的變化及意義

李金艷1，曾 敏2,王秦川1△

(重慶市中醫(yī)院:1．婦產(chǎn)科，2.病理科 400011)

目的 探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在妊娠期糖尿病巨大兒臍帶動(dòng)脈血及靜脈血中水平及其在胎盤、臍帶血管的表達(dá)情況及意義。方法 選取2014年5月至2015年5月該院婦產(chǎn)科住院分娩的確認(rèn)為妊娠期糖尿病并分娩巨大兒的初產(chǎn)婦為巨大兒組(n=30)，同期分娩的正常體質(zhì)量新生兒初產(chǎn)婦為對(duì)照組(n=30)。用放射免疫分析法分別測(cè)定巨大兒組及對(duì)照組臍靜脈血及臍動(dòng)脈血中VEGF水平，用免疫組化法分別測(cè)定VEGF在巨大兒組及對(duì)照組胎盤及臍動(dòng)脈、臍靜脈的表達(dá)情況。結(jié)果 巨大兒組臍靜脈血和臍動(dòng)脈血清中VEGF水平分別為(30.74±4.82)pg/mL 和(22.67±5.65)pg/mL，明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。VEGF在巨大兒組胎盤、臍動(dòng)脈及臍靜脈表達(dá)A值分別為0.454±0.024、0.381±0.023、0.367±0.049，較對(duì)照組明顯升高(P<0.01 )。結(jié)論 妊娠期糖尿病巨大兒臍血中VEGF水平增高，VEGF在妊娠期糖尿病巨大兒臍帶及胎盤組織中表達(dá)增強(qiáng)。

糖尿病,妊娠；胎盤；臍血；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；巨大兒

隨著全球代謝疾病流行，妊娠期糖尿病(GDM)的發(fā)生率逐年升高[1]。GDM誘導(dǎo)外周血處于異常環(huán)境，引起血管結(jié)構(gòu)改變，從而進(jìn)一步影響胎盤發(fā)育及功能。異常的胎盤功能對(duì)胎兒代謝有嚴(yán)重影響，導(dǎo)致巨大兒、肩難產(chǎn)及圍產(chǎn)兒死亡的發(fā)生率增加。妊娠期糖尿病孕婦分娩的新生兒在成年期較容易出現(xiàn)肥胖、心血管疾病及糖尿病[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分裂，影響胎盤血管發(fā)育。本研究進(jìn)一步探討了VEGF在妊娠期糖尿病巨大兒發(fā)生中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年5月至2015年5月在本院婦產(chǎn)科住院分娩的確診為GDM并分娩巨大兒的初產(chǎn)婦為巨大兒組(共30例)，選取同期分娩的正常體質(zhì)量新生兒的初產(chǎn)婦為對(duì)照組(共30例)。兩組均為單胎妊娠，無胎膜早破、妊娠期高血壓、前置胎盤、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、胎盤早剝等其他妊娠合并癥及并發(fā)癥，兩組均無糖尿病家族史。所有新生兒Apgar評(píng)分均大于7分，無新生兒畸形，無宮內(nèi)感染。GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]：在妊娠24～28周對(duì)孕婦進(jìn)行75 g OGTT。75 g OGTT的診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹及服糖后1、2 h的血糖值分別為5.1、10.0、8.5 mmol/L。任何一點(diǎn)血糖達(dá)到或超過上述標(biāo)準(zhǔn)即診斷為GDM。巨大兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：足月出生體質(zhì)量大于4.00 kg。正常體質(zhì)量?jī)褐赋錾w質(zhì)量在2.50～4.00 kg。巨大兒組產(chǎn)婦年齡為21～37歲，平均(25.1±3.4)歲；平均孕周為(37.6±2.4)周；新生兒平均出生體質(zhì)量為(4.30±0.24)kg。對(duì)照組產(chǎn)婦年齡為22～36歲，平均(25.4±3.1)歲；平均孕周為(38.1±1.9)周；新生兒平均出生體質(zhì)量為(3.00±0.22)kg。兩組產(chǎn)婦在年齡及孕周上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

1.2 方法

1.2.1 臍動(dòng)脈血及臍靜脈血中VEGF水平測(cè)定 經(jīng)得產(chǎn)婦同意后，當(dāng)胎兒娩出斷臍后用空針分別抽取臍靜脈血和臍動(dòng)脈血各3 mL將其注入不抗凝的玻璃管中，然后靜置30 min，在4 000 r/min下進(jìn)行離心10 min，使血清分離，放在-20 ℃ 的進(jìn)行保存。按照放射免疫分析方法進(jìn)行VEGF水平測(cè)定[3]。

1.2.2 胎盤組織、臍動(dòng)脈及臍靜脈采集 胎盤娩出后，取母面中央部位組織避開肉眼可見的明顯鈣化區(qū)及壞死區(qū)取大小約1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm組織兩塊。用眼科剪先剪去臍血管周圍的華通膠組織，然后分別剪下臍動(dòng)脈長(zhǎng)約1.0 cm，臍靜脈長(zhǎng)約1.0 cm，將以上組織分別放置在10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.2.3 VEGF在胎盤、臍動(dòng)脈及臍靜脈表達(dá)及定位 全部石蠟切片均常規(guī)脫蠟，過梯度乙醇水化。使用兔抗人VEGF單克隆抗體免疫組化試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，采用免疫組化SP法，操作步驟嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)染色為棕黃色顆粒即為VEGF陽性反應(yīng)的細(xì)胞；陰性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)未著色。顯微鏡下肉眼評(píng)估制片質(zhì)量合格后采用TD2000軟件系統(tǒng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)每張切片的5個(gè)視野中陽性染色部位的積分吸光度值(A)，及測(cè)量區(qū)域的面積(去除血管腔面積)，計(jì)算出平均吸光度值(mean density)，并取平均值來表示VEGF的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臍動(dòng)脈及臍靜脈血VEGF水平比較 分析比較發(fā)現(xiàn)巨大兒組GDM臍動(dòng)脈血VEGF水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；GDM臍靜脈血VEGF水平明顯高于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；見表1。

2．2 兩組胎盤中VEGF的表達(dá)及定位 兩組孕婦的胎盤中均有VEGF蛋白的表達(dá)。在胎盤中VEGF主要定位于胎盤的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞和絨毛間質(zhì)細(xì)胞。巨大兒組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及絨毛間質(zhì)細(xì)胞陽性著色明顯增多。與巨大兒組比較，對(duì)照組的著色明顯減少，見圖1。

表1 兩組臍靜脈血及臍動(dòng)脈血中VEGF水平對(duì)比

a:P<0.01,與巨大兒組比較。

A:巨大兒組;B:對(duì)照組。

圖1 VEGF在兩組胎盤組織中的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)×200)

2.3 兩組臍帶血管中VEGF的表達(dá)及定位 不論在臍靜脈和臍動(dòng)脈中VEGF的表達(dá)主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。巨大兒組臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞陽性著色明顯增多，與巨大兒組比較，對(duì)照組的著色明顯減少，見圖2A、B。巨大兒組臍動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞陽性著色明顯增多，與巨大兒組比較，對(duì)照組的著色明顯減少，見圖2C、D。

A：巨大兒組臍靜脈血管；B：對(duì)照組臍靜脈血管；C：巨大兒組臍動(dòng)脈血管；D：對(duì)照組臍動(dòng)脈血管。

圖2 兩組臍帶血管中VEGF的表達(dá)及定位(免疫組織化學(xué)×200)

2.4 比較VEGF在兩組中胎盤、臍靜脈及臍動(dòng)脈中表達(dá)平均A值比較 巨大兒組在胎盤、臍動(dòng)脈及臍靜脈中VEGF表達(dá)所測(cè)到的VEGF的平均A值均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 兩組胎盤、臍動(dòng)脈及臍靜脈中VEGF表達(dá)平均A值比較

a:P<0.01,與巨大兒組比較。

3 討 論

妊娠期胎盤是胎兒和母親進(jìn)行循環(huán)、物質(zhì)交換的重要基礎(chǔ)。糖尿病的環(huán)境對(duì)胎盤的形成和功能有顯著影響[4-5]。母親和胎兒的高血糖不僅影響著胎盤蛋白的產(chǎn)生同時(shí)影響著胎盤的代謝、生長(zhǎng)及發(fā)育[6-7]；而血管的形成和重塑對(duì)胎兒及胎盤生長(zhǎng)是至關(guān)重要的。血管形成主要被許多前血管形成因子和抗血管形成因子調(diào)控。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子起著重要作用。VEGF在結(jié)構(gòu)上是一個(gè)二聚體蛋白，它在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活和遷移中起著重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的生物作用主要通過結(jié)合在細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶受體VEGFR-1和VEGFR-2介導(dǎo)。在妊娠早期，VEGF是胎盤血管發(fā)育的驅(qū)動(dòng)者，負(fù)責(zé)內(nèi)皮細(xì)胞前體的分化、生長(zhǎng)、聚集及臍帶形成。VEGFR-2在胎兒、胎盤的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)并介導(dǎo)細(xì)胞的有絲分裂，而VEGFR-1則位于胎盤的巨噬細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞，并且是VEGFR-2信號(hào)重要的調(diào)控者[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠6周至妊娠20周時(shí)，VEGF水平隨著孕周逐漸增加至妊娠26周至妊娠30周。從妊娠26～30周至分娩時(shí)，VEGF水平逐漸下降。在孕早期人胎盤發(fā)育處于缺血/缺氧環(huán)境，從而引起了VEGF水平升高以滿足胎盤生長(zhǎng)需求。在孕中、晚期隨著新陳代謝增加，VEGF升高以促進(jìn)胎盤血管生成和胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的增長(zhǎng)。胎盤高度血管化是為了胎兒能從母親得到足夠的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)帶走胎兒代謝[10-11]。在GDM中，胎盤絨毛基質(zhì)輕度水腫伴有過度表達(dá)的霍夫包爾細(xì)胞(即胎盤固有巨噬細(xì)胞)，隨著這些細(xì)胞數(shù)量增加引起了胎盤細(xì)胞因子(如瘦素、TNF2，白細(xì)胞介素)的大量釋放，從而調(diào)整胎盤的代謝和內(nèi)分泌功能。

為了滿足胎兒生長(zhǎng)需要，在整個(gè)妊娠期間胎盤血管快速擴(kuò)張。胎盤或胎兒循環(huán)中各種生長(zhǎng)因子刺激和調(diào)控血管發(fā)生和生長(zhǎng)。缺氧是血管發(fā)生重要調(diào)控者。當(dāng)血管中氧供應(yīng)不能滿足代謝需求時(shí)，缺氧通過調(diào)控多個(gè)前血管物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平、mRNA穩(wěn)定性及翻譯來影響其表達(dá)。缺氧通過誘導(dǎo)VEGF表達(dá)來影響VEGF的行為。VEGF不僅在血管形成和血管通透性中起重要作用，同時(shí)維持內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。在GDM中胎兒高血糖和高胰島素血癥引起胎兒慢性缺氧。在GDM中胎盤處于高血管化提示因糖尿病代謝紊亂使胎盤血管具有較高的可塑性，高血糖和高胰島素水平會(huì)引起激素、生長(zhǎng)因子和促炎性細(xì)胞因子改變，從而影響胎盤血管的生成和血管發(fā)育。經(jīng)研究已明確在GDM中母親胎盤氧供是減少的。除了受損的氧供，胎兒氧需求是增加的，這是因?yàn)槟赣H的高血糖導(dǎo)致胎兒高血糖，致使胎兒代謝和激素發(fā)生改變[12]。一旦胎兒胰腺開始分泌胰島素，胎兒的高血糖導(dǎo)致了胎兒高胰島素血癥，兩者同時(shí)影響胎兒代謝，隨之發(fā)生的是胎兒氧需求增加引起胎兒慢性缺氧。通過測(cè)定胎兒臍血氧、臍血中促紅細(xì)胞生成素及臍血中血紅蛋白表面胎兒處于缺氧狀態(tài)，這樣胎兒的低氧水平上調(diào)了前血管生成因子(如VEGF或FGF2)的轉(zhuǎn)錄合成。在GDM中胎兒慢性缺氧潛在的調(diào)控因子包括VEGF、PIGF/FGF2[13]，這些因子促進(jìn)了胎盤內(nèi)皮細(xì)胞增殖、胎盤毛細(xì)血管增生和提高新形成血管的滲透性，從而增加了毛細(xì)血管表面積[14]。GDM中胎盤血管高度增生、血管化使交換面積增加能促進(jìn)胎盤中氧擴(kuò)散以代償氧的供應(yīng)不足。 在妊娠中晚期，GDM對(duì)胎盤影響主要表現(xiàn)在微血管重建，在GDM中毛細(xì)血管表面積增長(zhǎng)是通過提高絨毛毛細(xì)血管的分支。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GDM對(duì)胎兒血管生長(zhǎng)和血管發(fā)生的影響表現(xiàn)在GDM中臍帶長(zhǎng)度更長(zhǎng)并伴發(fā)更高的臍帶纏繞[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，巨大兒組臍血中VEGF水平明顯高于對(duì)照組，說明因GDM中缺氧和高血糖上調(diào)了VEGF的水平。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)巨大兒組在臍靜脈和臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中VEGF表達(dá)均高于對(duì)照組；同時(shí)巨大兒組胎盤中細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和絨毛間質(zhì)細(xì)胞中VEGF的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。

綜上所述，當(dāng)發(fā)生GDM時(shí)，胎兒糖尿病環(huán)境來自于母親，宮內(nèi)環(huán)境受到破壞，胎兒高血糖引起胎兒高胰島素血癥和缺氧。缺氧是血管發(fā)生重要的調(diào)控者再加上糖尿病環(huán)境刺激了胎兒血循環(huán)中VEGF水平，導(dǎo)致臍帶血管及胎盤血管中VEGF表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)胎盤血管過度形成，加速胎兒發(fā)育，增加巨大兒發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

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Differential expression of vascular endothelial growth factor in placenta and corn in macrosomia of gestational diabete mellitus

LiJinyan1,ZengMing2,WangQinchuan1△

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology;2.DepartmentofPathology,TheHospitalofTraditionalChineseMedicineofChongqingcity,Chongqing400011,China)

Objective To investigate the value of vascular endothelial growth factor(VEGF)in umbilical venous and arterial blood and the changes of VEGF in placenta and corn of macrosomia delivered by gestational diabetes mellitus mothers so that we can explore the role of vascular endothelial growth factor in the development of macrosomia.Methods We studied 60 cases between May 2014 and May 2015,including 30 cases of macrosomias who′s mothers were gestational diabetes mellitus patients as observation group and 30 cases of normal weight newborns who′s mothers were healthy as control group.The umbilical venous and arteria1 blood from all cases were collected for detecting the level of VEGF by the radioimmunoassay method;The method of immunohistochemstry was used to explore the expression of VEGF in which were placenta,umbilical venous and umbilical arterial in all cases.Results The levels of VEGF in umbilical vein and umbilical arterial in observation group were (30.74±4.82)pg/mL and (22.67±5.65)pg/mL,respectively.Those were significantly higher than that in the control group(P<0.01);The expressing of VEGF in placenta,umbilical vein and umbilical artery in observation group were(0.454±0.024),(0.381±0.023),and(0.367±0.049),Which were significantly higher than the control group(P<0.01).Conclusion The change of VEGF has strong relationship with the development of macrosomia in gestation diabete mellitus.The increased VEGF in umbilical vein blood and umbilical arterial blood can lead to the induction of macrosomia;the VEGF over expression in placenta and cord vessel are important factor to accelerate fetal overgrowth.

diabetes,gestational;placenta;fetal blood;vascular endothelial growth factor;macrosomia

李金艷(1978-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:974317278@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.017

R714.256

A

1671-8348(2016)34-4805-03

2016-05-12

2016-08-11)