仲吉英，張 濤，徐 楓，文先杰，梁 樺

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院麻醉科 528000)

鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)背根結(jié)慢性壓迫痛大鼠脊髓CaMKⅡ表達(dá)的影響

仲吉英，張 濤△，徐 楓，文先杰，梁 樺

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院麻醉科 528000)

目的 觀察鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)背根節(jié)慢性受壓痛大鼠(CCD)脊髓CaMKⅡ表達(dá)的影響，探討右美托咪定-CaMKⅡ通路在大鼠背根節(jié)慢性受壓痛中的作用。方法 鞘內(nèi)置管成功的雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組48只。分別是正常對(duì)照組(C組)；模型組(CCD組)；生理鹽水組(NS組)；右美托咪定2 μg/kg組(Dex2)；右美托咪定4 μg/kg組(Dex4)；右美托咪定8 μg/kg組(Dex8)。分別于鞘內(nèi)置管前(T1)，制備CCD模型前(T2)、CCD模型制備后5 d鞘內(nèi)給藥前(T3)、鞘內(nèi)給藥后30 min(T4)、60 min(T5)、120 min(T6)、240 min (T7) 檢測(cè)大鼠機(jī)械縮腿閾值(MWT)和熱縮足潛伏期(TWL)。并于鞘內(nèi)給藥后240 min，各組取4只大鼠處死，取脊髓腰膨大，采用免疫印跡法檢測(cè)CaMKⅡ的表達(dá)。結(jié)果 與C組比較，CCD組大鼠在T3～T7各時(shí)點(diǎn)MWT及TWL均顯著降低，CCD組大鼠表現(xiàn)為明顯的機(jī)械痛敏感和熱痛敏感。 NS組大鼠鞘內(nèi)注射NS后對(duì)大鼠MWT及TWL無(wú)影響，鞘內(nèi)注射不同劑量的右美托咪定則可顯著提高CCD大鼠MWT和TWL。與C組(0.24±0.04)比較，CCD組(0.59±0.09)、NS組(0.61±0.08)大鼠CaMKⅡ蛋白表達(dá)均顯著增加；鞘內(nèi)注射不同劑量的右美托咪定后，大鼠脊髓CaMKⅡ蛋白表達(dá)(0.45±0.06、0.39±0.05、0.36±0.06)增加幅度顯著降低。結(jié)論 鞘內(nèi)注射右美托咪定可減輕CCD大鼠機(jī)械痛敏感和熱痛敏感，抑制CCD大鼠脊髓CaMKⅡ蛋白表達(dá)。

神經(jīng)痛；脊髓；大鼠；右美托咪定；CaMKⅡ；背根節(jié)

右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)為高選擇性α2腎上腺素能受體(α2AR) 激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮及交感神經(jīng)抑制等作用[1]。同時(shí)，鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)可通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，誘導(dǎo)痛覺(jué)敏化，參與慢性神經(jīng)病理性疼痛外周敏化和中樞敏化[2]。而右美托咪定對(duì)CaMKⅡ有何影響目前尚不明確，本研究通過(guò)建立大鼠背根節(jié)慢性受壓痛大鼠模型(Chronic compression of dorsal root ganglia，CCD),觀察鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)CCD大鼠脊髓CaMKⅡ表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器試劑 雄性SD大鼠48只,體質(zhì)量(230±20) g,由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；CaMKⅡ抗體(美國(guó)Bioworld Technology公司)；熱痛刺激儀BME-410A(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)；Von Frey細(xì)絲(美國(guó)Stoelting公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 雄性SD大鼠48只,鞘內(nèi)置管成功后，隨機(jī)分為6組，每組8只(n=8)。分別是對(duì)照組(C組)，大鼠不做任何處理；CCD組，僅制備CCD大鼠模型；生理鹽水組(NS組)，CCD模型后第5天鞘內(nèi)給予生理鹽水20 μL；右美托咪定2、4、8 μg/kg組(Dex2、Dex4、Dex8組)：CCD模型后第5天分別鞘內(nèi)注射右美托咪定2、4、8 μg/kg，容量為20 μL。

1.3 鞘內(nèi)置管[3]戊巴比妥(1%,40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，以髂嵴連線與脊柱交點(diǎn)為第5腰椎間隙。平脊柱方向切開(kāi)L4/5椎間隙皮膚，將椎旁肌鈍性分離，部分鉗去L4脊突，使L4/5椎間隙暴露。將8號(hào)針頭插入椎間隙傾斜，角度約60°。當(dāng)大鼠尾部擺動(dòng)或后肢突然抽動(dòng)提示已經(jīng)進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔。退出針頭，將PE10管置入L4/5間隙，見(jiàn)管腔中有清亮液體證實(shí)導(dǎo)管位于蛛網(wǎng)膜下腔。將導(dǎo)管朝尾端方向插入1 cm，以1號(hào)絲線分層縫合肌肉與皮膚。經(jīng)皮下隧道將導(dǎo)管妥善安置至大鼠頸后，燒灼封閉導(dǎo)管外口。腹腔注射青霉素每天10 MU，連續(xù)3次，獨(dú)籠飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，自由攝水和攝食。置管后第4天經(jīng)導(dǎo)管注射2%利多卡因10 μL，以確定導(dǎo)管位置。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MWT的比較

a：P<0.05，與C組比較;b：P<0.05，與CCD組比較;c：P<0.05，與NS組比較;d：P<0.05，與Dex2比較;e：P<0.05，與Dex4比較。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)TWL的比較

a：P<0.05與C組比較;b：P<0.05，與CCD組比較;c：P<0.05，與NS組比較;d：P<0.05，與Dex2比較;e：P<0.05，與Dex4比較。

1.4 CCD模型制備[4]戊巴比妥(1%,40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，于L4、L5椎間隙為中點(diǎn)切皮，分離脊椎右側(cè)肌肉，暴露L4 、L5橫突和椎間孔，用彎成直角的長(zhǎng)3.5 mm，粗細(xì)0.7 mm的鋼棒，以與背部正中線成30°以及與脊柱側(cè)面水平線成10°向頭背端插入L4和L5椎間孔，當(dāng)鋼棒碰到背根節(jié)或神經(jīng)根時(shí)同側(cè)后肢抽動(dòng)，適當(dāng)調(diào)整鋼棒的位置，使其形成對(duì)L4和L5背根節(jié)穩(wěn)定的壓迫。腹腔注射青霉素每天10 MU，連續(xù)3次,剔除手術(shù)后肢體癱瘓的動(dòng)物。

1.5 觀察指標(biāo) 分別于鞘內(nèi)置管前(T1)，制備CCD模型前(T2)、CCD模型制備后5 d鞘內(nèi)給藥前(T3)、鞘內(nèi)給藥后30 min(T4)、60 min(T5)、120 min(T6)、240 min(T7)檢測(cè)大鼠機(jī)械縮腿閾值(MWT)和熱縮足潛伏期(TWL)。并于鞘內(nèi)給藥后240 min，各組取4只大鼠處死，取脊髓腰膨大，采用免疫印跡法檢測(cè)CaMKⅡ的表達(dá)。

1.5.1 MWT的測(cè)定[5]將大鼠置于有機(jī)玻璃箱上(大小22 cm×12 cm×22 cm，箱底部為金屬篩網(wǎng))，待其適應(yīng)15 min后，用Von Frey纖維絲刺激大鼠后肢足底中部，當(dāng)大鼠抬足或舔足行為時(shí)則為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。首先從2 g開(kāi)始測(cè)定，當(dāng)該力度的刺激不能引起陽(yáng)性反應(yīng)，則給予相鄰大一級(jí)力度的刺激；如出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)則給予相鄰小一級(jí)力度的刺激，如此連續(xù)進(jìn)行，直至出現(xiàn)第一次陽(yáng)性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測(cè)定4次。最大力度為15 g，大于此值時(shí)記為15 g。

1.5.2 TWL的測(cè)定[6]將大鼠置于有機(jī)玻璃箱上(大小22 cm×12 cm×22 cm，箱底部為3 mm厚的玻璃板)，按Hargreaves法用熱痛刺激儀照射大鼠足底。從照射開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間為TWL。如此時(shí)間超過(guò)25 s，則自動(dòng)切熱刺激，以免造成組織損傷。每只大鼠測(cè)定5次，每次間隔3 min，取中間3次平均值為大鼠TWL值。

1.5.3 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè) 取大鼠脊髓腰膨大，勻漿并提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)樣本取50 μg總蛋白上樣，7.5% SDS-PAGE電泳后，以半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用5%的脫脂牛奶封閉，4 ℃過(guò)夜。次日加入CaMKⅡ一抗(1∶300)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST沖洗5 min×5次，最后加入辣根酶標(biāo)記的兔抗羊二抗(1∶500)，室溫孵育1 h，TBST沖洗5 min×5次，ECL顯色。采用江蘇南京捷達(dá)801成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以目的蛋白條帶的A值與內(nèi)參蛋白A值的比值代表目的蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠MWT 和TWL 與C組比較，CCD組大鼠在T3～T7各時(shí)點(diǎn)MWT及TWL均顯著降低，CCD大鼠表現(xiàn)為明顯的機(jī)械痛敏感和熱痛敏感。 NS組大鼠鞘內(nèi)注射NS后對(duì)大鼠MWT及TWL無(wú)影響，鞘內(nèi)注射不同劑量的右美托咪定則可顯著提高CCD大鼠MWT和TWL，且與右美托咪定的劑量相關(guān)，見(jiàn)表1、2組。

圖1 疫印跡檢測(cè)CaMKⅡ蛋白的代表性條帶

2.2 CaMKⅡ蛋白的表達(dá) 與C組(0.24±0.04)比較，CCD組(0.59±0.09)、NS組(0.61±0.08)大鼠CaMKⅡ蛋白表達(dá)均顯著增加，鞘內(nèi)注射不同劑量的右美托咪定后，大鼠脊髓CaMKⅡ蛋白表達(dá)(0.45±0.06、0.39±0.05、0.36±0.06)增加幅度顯著降低。與C組比較，CCD組、NS組大鼠CaMKⅡ蛋白表達(dá)均顯著增加，且與右美托咪定的給藥劑量相關(guān)，見(jiàn)圖1。

3 討 論

神經(jīng)病理性疼痛屬慢性疼痛，是由軀體感覺(jué)神經(jīng)損傷或病變直接造成的疼痛，臨床表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏和感覺(jué)異常等，臨床治療困難，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。右美托咪定為高選擇性α2腎上腺素能受體(α2AR) 激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮及交感神經(jīng)抑制等作用。目前對(duì)右美托咪定鎮(zhèn)痛作用的研究主要集中在切口痛等急性疼痛[7]，也可減輕慢性神經(jīng)病理性疼痛[8-9]，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。

研究證實(shí)，T型鈣通道參與了神經(jīng)病理性疼痛的形成、發(fā)展和維持，T型鈣通道已經(jīng)成為神經(jīng)病理性疼痛的重要靶點(diǎn)[10-11]。T型鈣通道屬于低電壓依賴性鈣通道，在靜息電位下即可激活，使細(xì)胞外鈣離子在靜息狀態(tài)下經(jīng)T型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使神經(jīng)元的興奮性增加，形成神經(jīng)病理性疼痛。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡ也參與了慢性神經(jīng)病理性疼痛，如坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎大鼠脊髓CaMKⅡ表達(dá)上調(diào)[2]。

在神經(jīng)病理性疼痛模型中，右美托咪定與CaMKⅡ之間的相互調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，背根節(jié)慢性壓迫痛大鼠脊髓CaMKⅡ表達(dá)增加，鞘內(nèi)注射右美托咪定后脊髓CaMKⅡ的表達(dá)減少。作者推測(cè)，在背根節(jié)慢性受壓痛模型中，右美托咪定使細(xì)胞內(nèi)鈣離子增高，一方面激活細(xì)胞內(nèi)鈣依賴性鈣釋放，細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放大量鈣離子，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，激活Ca2+/CaMKⅡ信號(hào)，形成右美托咪定-CaMKⅡ通路，參與了慢性神經(jīng)病理性疼痛的形成。

綜上所述，鞘內(nèi)注射右美托咪定可減輕大鼠機(jī)械痛敏感和熱痛敏感，同時(shí)抑制脊髓CaMKⅡ的表達(dá)，提示右美托咪定- CaMKⅡ通路可能共同參與了慢性神經(jīng)病理性疼痛的形成。

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The effects of intrathecal injection dexmedetomidine on the CaMKⅡ expression in the spinal cord of the rats following chronic compression of dorsal root ganglia

ZhongJiying,ZhangTao△,XuFeng,WenXianjie,LiangHua

(DepartmentofAnesthesiology,theFirstPeople′sHospitalofFoshan,Foshan,Guangdong528000,China)

Objective To observe the effect of intrathecal injection dexmedetomidine and investigate the role of the T-type channel- CaMKⅡin the spinal cord of the rats following chronic compression of dorsal root ganglia (CCD).Methods 48 male SD rats after intrathecal Indwelling catheter were divided into 6 groups (n=8):Normal control group (C group);CCD model group (CCD group);Saline group (NS group);dexmedetomidine 2 μg/kg group (Dex2);dexmedetomidine 4 μg/kg group (Dex4);dexmedetomidine 8 μg/kg group (Dex8),Respectively.Mechanical withdrawal threshold (MWT) and thermal withdrawal latency (TWL) were measured at the following time point:before intrathecal Indwelling catheter(T1),before preparation of CCD model (T2),after 30 min (T4),60 min (T5),120 min (T6),240 min (T7) intrathecal administration.CaMKⅡ protein in the spinal of the rats (4 rats in every group) were detected with western blotting.Results Compared with the rats in C group,the MWT and TWL of the rats in CCD group significantly decreased.There were no difference of the MWT and TWL of the rats in NS group.Intrathecal injection different dosages of the dexmedetomidine can significantly improve MWT and TWL of the CCD rats.Conclusion Intrathecal injection dexmedetomidine can reduce the CCD rats MWT and TWL,down regulate the CaMKⅡ protein expression of the CCD rats.

neuralgia;spinal cord;rats;dexmedetomidine;CaMKⅡ;dorsal root section

仲吉英(1967-)，主任醫(yī)師，碩士，主要從事臨床麻醉工作。△

，E-mail:freezhangtao@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.004

R441.1

A

1671-8348(2016)34-4763-03

2016-07-18

2016-10-06)