趙 帥，董文斌，李清平，康 蘭，雷小平，周正頤

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒科，四川瀘州 646000)

沉默Pin1表達(dá)抑制高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡中SIRT1核-漿穿梭*

趙 帥，董文斌△，李清平，康 蘭，雷小平，周正頤

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒科，四川瀘州 646000)

目的 通過沉默Pin1表達(dá)觀察高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡中組蛋白去乙?；?SIRT1)核-漿穿梭改變。方法 在體外常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞及A549-Pin1shRNA細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))和高氧組、A549-Pin1shRNA細(xì)胞組(均給予高體積分?jǐn)?shù)氧誘導(dǎo)細(xì)胞)。密閉培養(yǎng)24 h后,倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)改變；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase 3、 p53蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況；免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭變化。結(jié)果 對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞呈梭形，活細(xì)胞數(shù)量較多。高氧組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差，細(xì)胞由原來的梭形變成橢圓形。A549-Pin1shRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳，貼壁欠佳，活細(xì)胞數(shù)量較高氧組有所增加，但是未達(dá)到對(duì)照組的水平。對(duì)照組密閉培養(yǎng)24 h,高氧組、A549-Pin1shRNA組通氧后密閉培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組中Caspase 3、p53表達(dá)最少，與高氧組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而A549-Pin1shRNA組在通氧后密閉24 h，Caspase 3、 p53表達(dá)介于對(duì)照組與高氧組之間，與各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭改變中，對(duì)照組未見SIRT1核-漿穿梭改變，而A549-Pin1shRNA組較高氧組減少。結(jié)論 抑制Pin1表達(dá)能夠減少人肺泡上皮細(xì)胞凋亡中SIRT1核-漿穿梭。

肺泡；上皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Pin1；SIRT1；核-漿穿梭

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的治療手段用于新生兒的救治過程，在救治過程中患兒往往需要長(zhǎng)時(shí)間吸入高體積分?jǐn)?shù)氧(高氧)，可能引起肺部出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)、肺血管重構(gòu)等，繼而發(fā)展至肺纖維化及支氣管肺發(fā)育不良(BPD)[1]。BPD仍是目前兒童慢性呼吸系統(tǒng)疾病中最主要的病因，其增加了兒童再入院率和病死率，嚴(yán)重影響兒童生長(zhǎng)發(fā)育及生活質(zhì)量[2]。組蛋白去乙酰化酶(SIRT1)作為哺乳動(dòng)物生命周期相關(guān)蛋白，其主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和調(diào)控生命周期。SIRT1主要定位于細(xì)胞核，在細(xì)胞能量代謝、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期控制、抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激和延長(zhǎng)細(xì)胞壽命方面發(fā)揮極重要的調(diào)控作用，是機(jī)體內(nèi)十分重要的抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白[3-4]。由于目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為氧化應(yīng)激是高氧肺損傷的主要形式，所以對(duì)其研究重點(diǎn)仍然是從信號(hào)通路入手。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得到證實(shí)，在高氧環(huán)境下會(huì)激活 PKCβ產(chǎn)生,從而使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)p66Shc發(fā)生磷酸化,隨后被Pin1識(shí)別發(fā)生異構(gòu)化(Pin1主要作用是介導(dǎo)p66Shc在線粒體轉(zhuǎn)位),進(jìn)而在蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A) 去磷酸化的作用下進(jìn)入線粒體，活化后的 p66Shc轉(zhuǎn)移到線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅲ氧化細(xì)胞色素c產(chǎn)生ROS/H2O2[5-7]。故在Pin1介導(dǎo)的p66shc轉(zhuǎn)位的氧化應(yīng)激通路中，通過抑制Pin1基因的表達(dá)，能夠減輕高氧誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生對(duì)肺組織的損傷[8]。而SIRT1一般情況下存在于細(xì)胞核內(nèi)，其活性主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，在機(jī)體內(nèi)參與部分組織的氧化應(yīng)激過程，當(dāng)其受到高氧損傷時(shí)，能否發(fā)生核-漿穿梭反應(yīng)，導(dǎo)致SIRT1活性降低，抗氧化應(yīng)激能力下降，而在抑制了Pin1表達(dá)的A549細(xì)胞中能否減輕SIRT1核-漿穿梭反應(yīng)都尚無相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)通過研究Pin1介導(dǎo)高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡中SIRT1核-漿穿梭情況，希望能夠?yàn)楦哐醴螕p傷治療提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在體外常規(guī)培養(yǎng)的人A549肺泡上皮細(xì)胞，分為對(duì)照組、高氧組，對(duì)照組置于5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，高氧組與前期課題組中抑制Pin1表達(dá)的A549-Pin1shRNA組細(xì)胞分別給予高體積分?jǐn)?shù)氧(高氧)誘導(dǎo)細(xì)胞[8]，即通入3 L/min的90%氧氣和5%二氧化碳高純混合氣10 min，并在培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)24 h后檢測(cè)下述指標(biāo)。

1.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 各組細(xì)胞分別密閉培養(yǎng)24 h后，在IX71型倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase 3、p53蛋白的表達(dá) 采用SP免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胱冬肽酶(Caspase) 3和p53蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)中Caspase 3和p53蛋白抗體的稀釋度分別為1∶150和1∶200。按照說明書進(jìn)行操作，細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色為陽性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每張爬片任選8個(gè)高倍鏡圖片，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，采用Image-pro6.0圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)定其平均吸光度值(A)。

1.4 免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭變化 細(xì)胞核采用DAPI染色成藍(lán)色熒光，SIRT1通過免疫熒光法染色成紅色熒光。正常情況下，SIRT1位于細(xì)胞核內(nèi)，紅色熒光與藍(lán)色熒光重合。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，SIRT1發(fā)生核-漿穿梭，從細(xì)胞核往細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)，紅色熒光向外移動(dòng)，通過熒光顯微鏡下觀察紅色熒光與藍(lán)色熒光分離的現(xiàn)象。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 建立高氧細(xì)胞模型，將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、高氧組和A549-Pin1shRNA組。通過倒置相差顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞呈梭形，活細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密，有少量細(xì)胞漂浮。高氧組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差，細(xì)胞由原來的梭形變成橢圓形，細(xì)胞之間間隙增寬，培養(yǎng)基中可見大量的懸浮細(xì)胞。A549-Pin1shRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳，貼壁欠佳，活細(xì)胞數(shù)量較高氧組有所增加，懸浮細(xì)胞數(shù)較高氧組減少，細(xì)胞之間間隙較對(duì)照組仍有增寬，但是未達(dá)到對(duì)照組的水平(圖1)。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，高氧組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差，細(xì)胞由原來的梭形變成橢圓形，A549-Pin1shRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳，活細(xì)胞數(shù)量較高氧組有所增加，懸浮細(xì)胞數(shù)較高氧組減少，細(xì)胞之間間隙較對(duì)照組仍有增寬，但未達(dá)到對(duì)照組的水平。

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase 3、p53蛋白的表達(dá) 在免疫組織化學(xué)法中Caspase 3、 p53蛋白陽性表達(dá)為位于細(xì)胞質(zhì)中的金黃色或者黃褐色。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組密閉培養(yǎng)24 h,高氧組、A549-Pin1shRNA組通氧后密閉培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)各種細(xì)胞中Caspase 3、 p53蛋白表達(dá)情況，結(jié)果通過A值進(jìn)行分析。 對(duì)照組中Caspase 3、 p53蛋白在3組中表達(dá)最少，在通氧后密閉24 h，高氧組細(xì)胞中Caspase 3和p53蛋白表達(dá)明顯增加(t=-9.941，P=0.006；t=-7.536，P=0.017)。A549-Pin1shRNA組在通氧后密閉24 h，Caspase 3和p53蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(t=5.439，P=0.012；t=6.87，P=0.000)，但低于高氧組(t=5.671，P=0.000；t=4.763，P=0.034)。見圖2、表1。

圖1 細(xì)胞形態(tài)變化(倒置相差顯微鏡，×100)

表1 各組Caspase 3、p53蛋白表達(dá)水平的A值比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與高氧組比較。

Caspase 3和p53蛋白陽性表達(dá)為位于細(xì)胞質(zhì)中的金黃色或者黃褐色。與對(duì)照組相比，高氧組和A549-Pin1shRNA組Caspase 3、p53蛋白陽性表達(dá)增加；A549-Pin1shRNA組中Caspase 3、p53蛋白陽性表達(dá)介于對(duì)照組與高氧組間。

圖2 SP細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase 3和 p53蛋白的表達(dá)(×200)

2.3 免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭改變 通過熒光顯微鏡對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行觀察。細(xì)胞核通過DAPI染色成藍(lán)色熒光，SIRT1通過免疫熒光法染色成紅色熒光，通過細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的熒光值(A值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過熒光顯微鏡下觀察紅色熒光與藍(lán)色熒光分離的現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)中紅色熒光明顯增多。在對(duì)照組中細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核為 0.00±0.00，在通氧后密閉24 h，高氧組SIRT1核-漿穿梭明顯增加，為0.36±0.12(t=5.932，P=0.001)，A549-Pin1shRNA組在通氧后密閉24 h，SIRT1核-漿穿梭增加，為0.21±0.09(t=4.217，P=0.015)。而A549-Pin1shRNA組中細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核較高氧組減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.346，P=0.000)，見圖3、表2。

表2 各組SIRT1細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的A值比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與高氧組比較。

細(xì)胞核通過DAPI染色成藍(lán)色熒光，SIRT1通過免疫熒光法染色成紅色熒光。高氧組中紅色熒光與藍(lán)色熒光分離明顯增高，而A549-Pin1shRNA組紅色熒光與藍(lán)色熒光分離低于高氧組，高于對(duì)照組。

圖3 免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭情況(倒置相差顯微鏡，×200)

3 討 論

由于機(jī)械通氣、肺表面活性物質(zhì)的普遍應(yīng)用及早產(chǎn)兒管理技術(shù)的提高，危重新生兒存活率顯著提高。與此同時(shí)，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)存活的患兒中肺部出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，繼而發(fā)展至肺纖維化及支氣管肺發(fā)育不良，對(duì)患兒生活質(zhì)量造成影響。所以越來越多的研究者將研究重點(diǎn)放在高氧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制上。

Pin1也稱作肽基脯氨酰異構(gòu)酶,其主要作用是能特異地識(shí)別和結(jié)合蛋白質(zhì)磷酸化的絲/蘇-脯氨酸基序，催化磷酸化的絲/蘇-脯氨酸肽鍵發(fā)生順反異構(gòu)，從而改變磷酸化蛋白質(zhì)的功能[9]。現(xiàn)在對(duì)于Pin1的主要研究熱點(diǎn)集中于以下幾個(gè)方面：(1)參與阿爾茲海默病信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[10]；(2)與cyclinD1參與細(xì)胞腫瘤周期的調(diào)控[11]；(3)激活線粒體p53通路的死亡程序[12]；(4)與磷脂酰肌醇5磷酸通過激活脯氨酸激酶參與氧化應(yīng)激通路，使活性氧的產(chǎn)生減少[13]。而本課題組前期證明，抑制Pin1表達(dá)后，與高氧組相比， Caspase 9產(chǎn)生減少，XIAP生成增加，活性氧出現(xiàn)減少，膜電位有所升高，說明Pin1參與了p66chc介導(dǎo)的氧化應(yīng)激通路，抑制其表達(dá)能夠有效減輕高氧所造成的急性肺損傷。

SIRT1也稱作沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1,是哺乳動(dòng)物sirtuin家族(SIRT1-SIRT7)成員之一，是一類具有NAD+依賴性的組蛋白/非組蛋白去乙?；竅14]。SIRT1抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與p53去乙酰化有關(guān)，其能使p53蛋白的第373、320和382位賴氨酸殘基去乙酰化，從而抑制p53與靶DNA順式原件結(jié)合，進(jìn)而抑制p53促凋亡活性[15]。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)SIRT1- p53信號(hào)通路研究主要集中在腦、腎臟、心肌等缺血再灌注損傷、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的血管病變中的保護(hù)作用。但是該通路與高氧肺損傷關(guān)系的研究，國內(nèi)外少見文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)主要是在抑制Pin1表達(dá)的A549細(xì)胞中，給予高氧誘導(dǎo)后，其與A549細(xì)胞的對(duì)照組和高氧組進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，A549-Pin1 shRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳，但活細(xì)胞數(shù)量較高氧組有所增加，懸浮細(xì)胞數(shù)較高氧組減少，細(xì)胞之間間隙較對(duì)照組仍有增寬，但是未達(dá)到對(duì)照組的水平。在免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果中得到，A549-Pin1 shRNA組Caspase 3、p53蛋白的表達(dá)較高氧組有所減少；在免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭改變中，A549-Pin1 shRNA組SIRT1核-漿穿梭較高氧組減少，減輕穿梭后造成的SIRT1活性的下降。

由此，推測(cè)Pin1介導(dǎo)高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡中SIRT1核-漿穿梭中，抑制Pin1表達(dá)能夠減少SIRT1從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)中穿梭，從而減少SIRT1活性降低、抗氧化應(yīng)激能力下降，此通路研究有望為高氧肺損傷治療提供新的治療方法。

[1]Vendettuoli V,Bellu R,Zanini R,et al.Changes in ventilator strategies and outcomes in preterm infants[J].Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed,2014,99(4):F321-324.

[2]El Mazloum D,Moschino L,Bozzetto S,et al.Chronic lung disease of prematurity:long-term respiratory outcome[J].Neonatology,2014,105(4):352-356.

[3]Chen HQ,Liu XB,Zhu W,et al.SIRT1 ameliorates age-related senescence of mesenchymal stem cells via modulating telomere shelterin[J].Front Aging Neurosci,2014,6(6):103-105.

[4]Wang B,Yang Q,Sun YY,et al.Resveratrol-enhanced autophagic flux ameliorates myocardial oxidative stress injury in diabetic mice[J].J Cell Mol Med,2014,18(8):1599-1611.

[5]Orsini F,Migliaccio E,Moroni M,et al.The Life span determinant p66Shc localizes to mitochondria where it associates with mitochondrial heat shock protein 70 and regulates trans-membrane potential[J].J Biol Chem,2004,279(24):25689-25695.

[6]Pinton P,Rimessi A,Marchi S,et al.Protein kinase C beta and prolyl isomerase 1 regulate mitochondrial effects of the life-span determinant p66Shc[J].Science,2007,315(5812):659-663.

[7]車忠麗，董文斌，李清平，等．PKCβ/p66Shc氧化應(yīng)激通路介導(dǎo)高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡的作用[J]．臨床兒科雜志，2013，31(11)：1066-1069．[8]趙帥，董文斌，張嬋，等．沉默Pin1表達(dá)抑制高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡[J]．中國當(dāng)代兒科雜志，2015，17(5)：496-501．

[9]Marhav? P,Duclercq J,Weller B,et al.Cytokinin controls polarity of PIN1-dependent auxin transport during lateral root organogenesis[J].Curr Biol,2014,24(9):1031-1037.

[10]Kimura T,Tsutsumi K,Taoka M,et al.Isomerase pin1 stimulates dephosphorylation of Tau protein at cyclin-dependent kinase (Cdk5)-dependent alzheimer phosphorylation sites[J].Journal of Biological Chemistry,2013,288(11):7968-7977.

[11]Ao R,Zhang DR,Du YQ,et al.Expression and significance of Pin1,beta-catenin and cyclin D1 in hepatocellular carcinoma[J].Mol Med Rep,2014,10(4):1893-1898.

[12]Sorrentino G,Mioni M,Giorgi C,et al.The prolyl-isomerase Pin1 activates the mitochondrial death program of p53[J].Cell Death Differ,2013,20(2):198-208.

[13]Keune WJ,Jones DR,Divecha N.PtdIns5P and pin1 in oxidative stress signaling[J].Adv Biol Regul,2013,53(2):179-189.

[14]Buhrmann C,Busch F,Shayan PA.Sirtuin-1 (SIRT1) is required for promoting chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells[J].J Bio Chem,2014,289(32):22048-22062.

[15]Zhang C,Feng Y,Qu S,et al.Resveratrol attenuates doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis in mice through SIRT1-mediated deacetylation of p53[J].Cardiovasc Res,2011,90(3):538-545.

Silencing of Pin1 suppresses the changes of SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling in apoptosis of human alveolar epithelial cells*

ZhaoShuai,DongWenbin△,LiQingping,KangLan,LeiXiaoping,ZhouZhengyi

(DepartmentofNeonatology,theFirstAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the role of silence Pin1 expression suppress the changes of SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling in apoptosis of human alveolar epithelial cells.Methods The A549 cells and A549-Pin1shRNA cells were divided into the control group,the hyperoxia group and the A549-Pin1shRNA group.The change of morphology were observed under inverted microscope after exposure to oxygen or room air for 24 hours;the expression of protein Caspase 3and p53 were detected by immunohistochemical methods.the change of SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling were detected by immunofluorescence.Results Under the inverted microscopy,A549 cells in control group grew in good condition,and were significantly increased.Cells in hyperoxia group grew in bad condition,and they turned to oval from the original fusiformis.Cells in the A549-Pin1shRNA group grew in bad condition,the live cell number increased compared with that of hyperoxia group,while they did not reach the control group level.After four hours culture in the control group and 24 hours in the hyperoxia group and A549-Pin1shRNA group,the Caspase 3 and p53 were the least in the control group,and there was significant difference of the level between control group and hyperoxia group(P<0.05).But the expression Caspase 3 and p53 of the A549-Pin1shRNA group were between them (P<0.05).Immunofluorescence results showed that the control group had no change of SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling.The A549-Pin1shRNA group were decreased than the hyperoxia group.Conclusion Inhibition of Pin1 expression can reduce the apoptosis of human alveolar epithelial cells SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling.

pulmonary alveoli;epithelial cells;apoptosis;Pin1;SIRT1;nucleocytoplasmic shuttling

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.003

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81571480);四川省教育廳科研基金(08ZA150)；四川省衛(wèi)生廳科研基金(90191);四川省科技廳-瀘州市科技局-瀘州醫(yī)學(xué)院2014年聯(lián)合科研項(xiàng)目資金(2014NZ0014);瀘州市科技局(瀘州市政府-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合專項(xiàng)資金)( 2013LZLY-J08);中華兒科雜志第二屆雙鶴珂立蘇科研基金。 作者簡(jiǎn)介：趙帥(1989-)，住院醫(yī)師，碩士，主要新生兒疾病基礎(chǔ)與臨床的研究。△

，E-mail：dongwenbin2000@163.com。

R722.1

A

1671-8348(2016)34-4760-03

2016-06-22

2016-08-26)