周學(xué)亮，方義湖，趙 勇，鄒 斌，徐 華，吳起才，劉季春

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科,南昌 330006)

論著·基礎(chǔ)研究

大鼠Hes1腺病毒干擾載體構(gòu)建及功能鑒定*

周學(xué)亮，方義湖#，趙 勇，鄒 斌，徐 華，吳起才，劉季春△

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科,南昌 330006)

目的 構(gòu)建高滴度大鼠Hes1腺病毒干擾載體(Ad-Hes1-shRNA)。方法 設(shè)計3對Hes1-shRNA寡核苷酸序列，通過定向克隆構(gòu)建pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA干擾質(zhì)粒，將pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA和pHBAd-BHG共轉(zhuǎn)染293T細胞，以包裝Ad-Hes1-shRNA，利用改進TCID50法進行病毒滴度測定。Ad-Hes1感染H9c2心肌細胞，Western blot檢測Hes1表達。結(jié)果 pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA構(gòu)建成功，Ad-Hes1-shRNA包裝順利，滴度為1.0×1011PFU/mL，并可在H9c2心肌細胞內(nèi)發(fā)揮干擾效應(yīng)。結(jié)論 Ad-Hes1-shRNA包裝成功，在心肌細胞中具有Hes1的干擾效應(yīng)。

腺病毒科；RNA干擾；寡核苷酸序列分析；Hes1；質(zhì)粒構(gòu)建；病毒包裝

發(fā)狀分裂相關(guān)增強子-1(hairy and enhancer of split 1,Hes1)作為經(jīng)典的抑制型堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix loop helix,bHIJH)基因，激活后可有效拮抗激活型bHLH基因的表達水平[1]；同時作為Notch信號通路靶基因，在減輕心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用[2]。本研究擬采用腺病毒載體系統(tǒng)，通過設(shè)計針對大鼠Hes1基因干擾序列，構(gòu)建Hes1腺病毒干擾載體(Ad-Hes1-shRNA)，并感染H9c2心肌細胞，篩選干擾大鼠Hes1基因最佳的Ad-Hes1-shRNA，為進一步觀察Hes1信號通路在心肌細胞的作用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及菌株 293T細胞購于中科院上海生命科學(xué)院細胞庫，DH5α超級化學(xué)感受態(tài)細胞購于Invitrogen公司。

1.1.2 大鼠cDNA文庫及腺病毒載體系統(tǒng) 大鼠cDNA文庫來購于大連TaKaRa公司；pHBAd-U6-CMV載體、pHBAd-BHG骨架質(zhì)粒購于漢恒生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ)購于New England Biolabs公司，T4 DNA Ligase購于Fermentas公司，質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收與純化試劑盒購于康為世紀(jì)有限公司，LipofiterTM購于為漢恒生物科技有限公司，細胞裂解液購于碧云天生物技術(shù)研究所，Hes1單克隆鼠抗購于Abcam公司，β-actin單克隆鼠抗購于Anbo公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，增強化學(xué)發(fā)光底物購于Pierce Biotechnology公司。

1.1.4 引物設(shè)計與合成 針對大鼠Hes1基因，設(shè)計3對Hes1-shRNA寡核苷酸序列(Hes1:5′-CCG GGC AAG AAT AAA TGA AAG TTT G-3′;N1ICD-shRNA-2:5′-CAG ACA TTC TGG AAA TGA CAG TGA A-3′;N1ICD-shRNA-3:5′-CCT CTG AGC ACA GAA AGT CAT CAA A-3′)，分別插入BamHⅠ與EcoRⅠ酶切位點，交上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成3對寡核苷酸，規(guī)格為2A。

1.2 方法

1.2.1 pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建及篩選 將3對寡核苷酸退火形成雙鏈，T4 DNA Ligase連接BamHⅠ與EcoRⅠ雙酶切后的雙鏈Oligonucleotide、pHBAd-U6-CMV。將3組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α化學(xué)感受態(tài)細胞，接種于Amp+(氨芐西林)的LB培養(yǎng)基平板，次日隨機挑選陽性單克隆菌落，搖菌過夜，菌液送上海桑尼生物技術(shù)有限公司基因測序，序列無誤后分別命名為pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA-1、pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA-2、pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA-3。

1.2.2 Ad-Hes1-shRNA包裝、收毒、擴增及滴度測定 將pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA 2 μg、pHBAd-BHG 4 μg共轉(zhuǎn)染293細胞，6 h后更換新鮮細胞培養(yǎng)液。每天觀察細胞出毒跡象，出毒完畢后收集所有細胞及培養(yǎng)液，于-80 ℃和37 ℃間凍融3次，3 000 r/min離心5 min，上清液即為Ad-Hes1第一代毒種(P1)，作為毒種-80 ℃保存。取P1代毒種感染293細胞，待所有細胞脫落底面開始收毒，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 mL ST buffer(培養(yǎng)液+10%血清+2.5%甘油)，Votex混勻，于-80 ℃和37 ℃間凍融3次，3 000 r/min離心5 min，取上清液(P2)-80 ℃保存。依前法利用P2代病毒大量擴增病毒，純化后利用改良TCID50法行病毒滴度測定。

1.2.3 Ad-Hes1-shRNA功能鑒定 H9c2細胞傳代107至6孔板，每孔分別加入約Ad-NC、Ad-Hes1-shRNA-1、Ad-Hes1-shRNA-2、Ad-Hes1-shRNA-3，4 h更換培養(yǎng)液，36 h后收集細胞蛋白，Western blot 檢測Hes1表達。

2 結(jié) 果

2.1 pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA干擾質(zhì)粒成功構(gòu)建 DNAMAN比對分析pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA陽性轉(zhuǎn)化子菌液基因測序結(jié)果，與Hes1-shRNA基因序列完全一致(圖1)。

2.2 Ad-Hes1-shRNA包裝、收毒、擴增及滴度測定 HBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA、pHBAd-BHG 共轉(zhuǎn)293細胞后，每天顯微鏡下觀察細胞出毒跡象，出毒現(xiàn)象為細胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑，待細胞大部分病變并從底部脫落進行收毒，待細胞大部分病變并從底部脫落進行收毒(圖2)。利用改進TCID50法測定Ad-Hes1-shRNA滴度，結(jié)果為1.0×1011PFU/mL，體積1 mL，總滴度為1.0×1011PFU。

圖1 Hes1-shRNA基因測序圖

圖2 顯微鏡下Ad-Hes1-shRNA細胞出毒情況(×20)

A：Hes1蛋白Western blot；B：Hes1蛋白灰度值。1：模擬感染組；2：Ad-Hes1-shRNA-1;3:Ad-Hes1-shRNA2;4:Ad-Hes1-shRNA-3。

圖3 Ad-Hes1-shRNA在H9c2心肌細胞內(nèi)的干擾效應(yīng)

2.3 Ad-Hes1功能鑒定 構(gòu)建成功的Ad-Hes1-shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后提總蛋白，Western blot顯示Ad-Hes1-shRNA-2、Ad-Hes1-shRNA-3均可達到滿意的干擾效果，以Ad-Hes1-shRNA-2干擾效果最強，見圖3。

3 討 論

Hes1的功能研究目前大多集中在神經(jīng)發(fā)育、體節(jié)形成、骨骼發(fā)育、T 淋巴細胞發(fā)育等四個方面[3]。最近研究證明Hes1在心臟發(fā)育中具有重要調(diào)節(jié)作用，積極影響心室流出道的發(fā)育成熟[4]。Bhoopathi等[5]發(fā)現(xiàn)Hes1基因表達可以顯著促進內(nèi)源性Stat3的酪氨酸磷酸化水平，并且在表皮生長因子誘導(dǎo)下，Hes1基因的表達使得Stat3更易轉(zhuǎn)運進入細胞核，增加DNA與Stat3的結(jié)合活性。在作者前期研究中，同樣發(fā)現(xiàn)作為Notch1信號通路靶基因，Hes1通過類似途徑促進Stat3磷酸化，從而激活SAFE信號通路，發(fā)揮強大的心肌保護作用。Hes1無特異性抑制劑，特異性抑制Hes1并非易事，因此利用RNAi技術(shù)，針對特定Hes1蛋白構(gòu)建相應(yīng)干擾載體，可達到特異性抑制Hes1的作用。

RNA干擾技術(shù)是一種由內(nèi)源性或者外源性雙鏈DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù)[6-7]。短發(fā)卡RNA(shorthairpin RNA,shRNA)是根據(jù)siRNA設(shè)計的類似雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA，相比于siRNA，其在隨載體進入細胞時具有更高的內(nèi)在穩(wěn)定性，并且shRNA在細胞內(nèi)可以由單個模板快速合成大量的shRNA，其沉默作用更加持久[8]。目前，用于目的基因轉(zhuǎn)移的病毒載體主要包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體[9]。與其他基因載體系統(tǒng)相比，腺病毒載體具有宿主范圍廣、可感染靜止及分裂期細胞、感染率高，靶細胞內(nèi)多拷貝高效表達，理化性質(zhì)穩(wěn)定，遺傳毒性較低，包裝容量大及不整合等優(yōu)點，已在基因載體領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[10]。因考慮后期研究涉及細胞及動物實驗，對病毒感染效率要求高，因此作者采用腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建Hes1干擾載體。

在Ad-Hes1-shRNA構(gòu)建過程中，作者先用合成3對Hes1-shRNA的寡核苷酸，退火形成雙鏈后利用定向克隆技術(shù)，構(gòu)建HBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA，再與pHBAd-BHG共轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝，細胞出毒后收集第一代(P1)毒液，并以此為毒種進行第二代(P2)出毒及大量病毒擴增，病毒滴度測定后，再感染H9c2心肌細胞，以篩選干擾效果最佳的Ad-Hes1-shRNA，從而為Hes1對缺血心肌細胞保護作用的機制研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

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Construction and functional identification of rat Hes1 adenovirus interference vector*

ZhouXueliang,FangYihu#,ZhaoYong,ZouBin,XuHua,WuQicai,LiuJichun△

(DepartmentofCardiovascularSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To construct the high titers rat Hes1 adenovirus interference vector (Ad-Hes1-shRNA).Methods 3 pairs of Hes1-shRNA oligonucleotide sequences were synthesized to construct the pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA interference plasmid by directly clone.pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA and pHBAd-BHG plasmids were co-transfected into 293 cells to Ad-Hes1-shRNA,virus titer are determined by modified TCID50.Hes1 was detected by Western blot after Ad-Hes1-shRNA infected with H9c2 myocardial cells.Results pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA was constructed successfully,Ad-Hes1-shRNA packaging smoothly with 1.0×1011PFU/mL titer,which can play the interference effect in the H9c2 myocardial cells.Conclusion The Ad-Hes1-shRNA is successfully packaged and has the interference effect of Hes1 in myocardial cells.

adenoviridae;RNA interference;oligonucleotide array sequence analysis;Hes1;plasmid construction;virus packaging

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.002

國家自然科學(xué)基金資助項目(81570262)；贛鄱555領(lǐng)軍人才計劃(贛組字[2013]58號)；江西省自然科學(xué)基金重大項目(20152ACB20026)。作者簡介：周學(xué)亮(1980-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事心肌疾病的信號通路研究#共同第一作者：方義湖(1971-)，教授，博士，主要從事心臟病理方面研究?！?/p>

,E-mail:liujichun999@163.com。

R654.2

A

1671-8348(2016)34-4757-03

2016-07-20

2016-09-08)