郭晶瑩，張紅萍

異丙醇/鹽雙水相分離制備高色價(jià)梔子黃

郭晶瑩，張紅萍

（邵陽學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽 422000）

采用異丙醇/鹽組成的雙水相體系分離梔子黃。綜合考察了鹽的種類、濃度、pH值和溫度等因素對(duì)梔子黃分離效果的影響，并且采用紫外-可見分光光度法和HPLC對(duì)異丙醇/鹽雙水相體系分離得到的梔子黃進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在35℃條件下由1.6g的檸檬酸三鈉和2mL的異丙醇組成雙水相體系，pH等于8.7，分離得到梔子黃和OD值分別為0.382、542。

梔子黃；分離；雙水相

Gardenia jasminoides Ellis（Rubiaceae）的中文名字是梔子，是一種藥食同源的藥材。梔子中的主要成分是梔子苷和梔子黃，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明梔子中的梔子苷具有多種藥理作用，例如抑制肝硬化、降低血糖、預(yù)防動(dòng)脈硬化和緩解失眠等［1-3］。梔子黃包括藏花素-1、藏花酸和少量的梔子苷，其中藏花素-1是藏花酸與單糖和二糖形成的酯類化合物，它是梔子黃中的主要成分。梔子黃是一種天然色素，廣泛用于食品染色和染料敏化太陽能電池中［4］。到目前為止，從梔子中分離純化梔子黃的方法有超臨界CO2、結(jié)晶、色譜以及大孔樹脂吸附等［5-8］。但是，這些方法存在耗時(shí)、生產(chǎn)成本高、操作繁瑣等缺點(diǎn)。因此，需要建立一種簡(jiǎn)單有效的方法，低成本、高效率地從梔子中分離梔子黃。

自從Albertson首次引用雙水相技術(shù)（ATPE）后，雙水相技術(shù)就作為一種高效的分離方法運(yùn)用到了生物活性成分的分離中，例如蛋白質(zhì)、酶和抗生素的分離［9-11］。經(jīng)典雙水相體系是由兩種互不相溶的高聚物或一種高聚物與一種無機(jī)鹽組成，通過使用ATPE，可以得到高純度和高收率的目標(biāo)產(chǎn)物，并且不會(huì)破壞目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性。最近Pan使用傳統(tǒng)的ATPS從梔子中成功分離得到梔子苷。這個(gè)雙水相體系是由20%的環(huán)氧乙烷和80%的氧化丙烯、KH2PO4和乙醇組成的［12］。相對(duì)于高聚物/鹽形成的雙水相，短鏈醇/親水溶劑組成的雙水相體系具有以下的優(yōu)點(diǎn)：低黏度，分相速度快，溶劑可以循環(huán)使用，低毒性。在異丙醇/鹽ATPS中，異丙醇-K3PO4-H2O體系被成功用于人尿液中睪酮和表睪酮的分離提?。?3］。目前為止，還沒有使用異丙醇/鹽雙水相體系分離梔子黃的報(bào)道。

本試驗(yàn)以異丙醇/鹽組成的雙水相體系進(jìn)行梔子黃的分離，討論了鹽的種類、濃度、pH值和溫度等因素對(duì)梔子黃分離效果的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 化學(xué)藥品及試劑

梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品（99.8% HPLC），藏花素-1（梔子黃，99.5%，HPLC），異丙醇，分析試劑鹽，其它用于試驗(yàn)和檢測(cè)的藥物均是分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)用水都是去離子水。C-18（SPD，日本）用于HPLC分析檢測(cè)，分析檢測(cè)過程中使用的溶劑是高效液相層析級(jí)溶劑。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 梔子果的粗提取液

從當(dāng)?shù)厮幍曩徺I干燥的梔子果實(shí)。將梔子果研磨干燥，過0.42mm的金屬篩，最終得到梔子果粉（500g）。采用索氏提取法，以石油醚（沸點(diǎn)60～90℃）為溶劑，去除果粉中的一部分多糖，然后將得到的果粉，用40%（4L）的乙醇冷凝回流2次，最終將乙醇提取液混合濃縮到1.0L，粗提取液在4℃條件下保存，備用。

2.2 雙水相體系的建立

采用濁點(diǎn)法繪制異丙醇-鹽雙水相圖［14］。實(shí)驗(yàn)操作如下：在15mL的離心管中，加入一定量的異丙醇，直至體系恰好形成渾濁，然后再滴加適量的水，使體系恰好形成渾濁。記錄每個(gè)濁點(diǎn)時(shí)，異丙醇的添加量和體系的總質(zhì)量。

2.3 雙水相體系中分離梔子黃

為了考察雙水相體系組成、鹽的添加量、體系的溫度和pH值對(duì)梔子黃分離效果的影響，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：取1mL梔子果粉的粗提取物（1g·mL-1）添加到雙水相體系中，在磁力攪拌下充分混合，然后靜置40min，分離上下相，測(cè)量上下相的體積，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量上下相中梔子黃的含量。

2.4 分析方法

2.4.1 工作曲線的繪制

藏花素-1是梔子黃混合物中含量最高的色素，所以選用它作為衡量梔子黃含量的標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)量不同濃度的藏花素-1在440 nm處的吸光度，繪制梔子黃的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 梔子黃標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The calibration curve of gardenia yellow

2.4.2 分配系數(shù)

梔子黃的分配系數(shù)（K）采用公式（1）計(jì)算：

式中，CT和CB分別是相平衡時(shí)梔子黃在上相和下相的濃度。

2.4.3 梔子黃的收率

式中，VT和VB分表代表上下相的體積。

2.4.4 梔子黃色價(jià)的測(cè)量

梔子黃的色價(jià)采用GB 7912-2010的標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行測(cè)量。具體操作如下：取0.015g的梔子黃標(biāo)準(zhǔn)品溶解在去離子水中，然后將溶液轉(zhuǎn)移到10mL的容量瓶中，定容；取1mL的液體，將其轉(zhuǎn)移到10mL的容量瓶中，定容；用UV-2600紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量梔子黃在440nm的吸光度（吸光度應(yīng)控制在0.3～0.7）。梔子黃的色價(jià)和OD值的計(jì)算采用下述公式：

式中，E是梔子黃的色價(jià)，A是溶液在440nm處的吸光度，C是稀釋后的梔子黃的濃度，g·mL-1。2.4.5 HPLC分析

用LC-20A的HPLC（二極管陣列檢測(cè)器和C18色譜柱，4.6nm×250nm，5μm）檢測(cè)藏花素-1。流動(dòng)相是甲醇（溶劑A）和水（溶劑B，含有0.1%醋酸）。按如下比例進(jìn)行洗脫：0～4min，20% A；4～40min，20%～90% A。 流 速：1.00mL·min-1；檢 測(cè) 波 長440nm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫30℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 鹽的種類和用量對(duì)雙水相體系的影響

為了選擇一個(gè)最佳的雙水相體系，在室溫下，研究了不同的鹽（磷酸氫二鉀、硫酸銨、檸檬酸三鈉、碳酸鉀）和異丙醇形成的雙水相體系對(duì)梔子黃的分離效果，結(jié)果如表1所示。當(dāng)使用2mL的異丙醇與鹽形成的雙水相，加入的粗提取液的體積是1.0mL時(shí)，這4種鹽對(duì)梔子黃的提取率影響有所不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)鹽的含量增加時(shí)，梔子黃在上相的K和Y都隨之增加。造成這一結(jié)果的主要原因是：隨著鹽含量的增加，高濃度的鹽引起鹽析作用，導(dǎo)致上相異丙醇含量升高，由此可以看出梔子黃易溶于異丙醇中。從表1可以看出，異丙醇-硫酸銨和異丙醇-檸檬酸三鈉對(duì)梔子黃色素回收率的影響相近。使用2.0g的硫酸銨形成雙水相，梔子黃在上相的分配系數(shù)和回收率分別是15.11和87.17%。對(duì)于2.0g的檸檬酸三鈉形成的雙水相體系，梔子黃的分配系數(shù)和回收率分別是13.87和86.44%。從環(huán)保的角度來說，使用檸檬酸三鈉比硫酸銨更合適，因?yàn)榱蛩徜@易引起湖泊的富營養(yǎng)化，而檸檬酸三鈉則可以被生物降解，對(duì)環(huán)境污染較小。因此，異丙醇-檸檬酸三鈉更適合用于梔子黃在上相的富集，同時(shí)，粗提取液中含有的其它成分進(jìn)入到雙水相的下相?；谏鲜鍪聦?shí)，后續(xù)的試驗(yàn)選用2g的檸檬酸三鈉與異丙醇形成的雙水相作為梔子黃的分離體系。

表1 不同鹽形成的雙水相體系對(duì)梔子苷和梔子黃富集體系的影響Table 1 Extraction of gardenia yellow using differrent isopanol/salt ATPS

3.2 溫度對(duì)雙水相體系的影響

為了考察溫度對(duì)梔子黃分離效果的影響，本試驗(yàn)考察20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下梔子黃的分離效果，其它實(shí)驗(yàn)均設(shè)在上述的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，梔子黃在上相的收率隨著溫度的升高而升高。但是，在20～40℃范圍內(nèi)，梔子黃在上相的收率變化都在80%左右。由此可見，溫度對(duì)梔子黃分離效果的影響很小。接下來的實(shí)驗(yàn)都在室溫下進(jìn)行。

3.3 pH對(duì)雙水相體系的影響

圖2 溫度對(duì)梔子黃收率的影響2.0mL isopropanol， 2g sodium citrate and 1.0mL crude xtracts of gardenia fruitsFig.3 Effect of temperature on the recovery of gardenia yellow

為了確定分離梔子黃的最佳雙水相體系，需要考察pH值對(duì)梔子黃分離效果的影響。采用不同體積比例的0.1mol·L-1HCl和0.1mol·L-1NaOH，調(diào)節(jié)體系上相的pH值，使pH在2～12之間，而其它的參數(shù)均為上述得到的最佳參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 pH對(duì)梔子黃分離效果的影響Table 2 Effect of pH on gardenia yellow partition behavior using isopropanol/ sodium citrate ATPS

由表2可知， 隨著體系pH值的改變，梔子黃在上相的收率有一個(gè)很小的波動(dòng)，但是收率基本在82%～85%之間變化。

3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取影響梔子黃提取效果各因素中有意義的水平做正交試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳的提取條件。采用L9（34）正交表，以檸檬酸三鈉（A）、溫度（B）、pH（C）作為3個(gè)考察因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。

表3 異丙醇-檸檬酸三鈉分離梔子黃工藝L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table3 Factors and levels for L9（34） orthogonal design

表4 異丙醇-檸檬酸三鈉提取梔子黃工藝L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table4 L9（34） orthogonal design and results

由表4的極差分析結(jié)果看出，這3個(gè)因素對(duì)異丙醇-檸檬酸三鈉分離梔子黃的影響大小依次為：檸檬酸三鈉的添加量（A）＞溫度（B）＞pH（C）。3個(gè)因素中，檸檬酸三鈉和溫度的影響較為顯著，其中，檸檬酸三鈉的添加量對(duì)分離效果影響最為顯著。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，優(yōu)化得到分離梔子黃的最佳試驗(yàn)條件為A2B3C3，即檸檬酸三鈉1.6g，提取溫度35℃，pH值為8.7。

3.5 雙水相分離梔子黃效果評(píng)價(jià)

取等體積的梔子黃粗提取液，按照上述最佳試驗(yàn)結(jié)果提取梔子黃，對(duì)得到的梔子黃進(jìn)行HPLC分析（檢測(cè)波長440nm，檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器）。從HPLC分析（圖3）可以看出，梔子黃標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為21.2min，經(jīng)過雙水相分離得到的梔子黃的保留時(shí)間也在21.2min，產(chǎn)物的純度達(dá)到87.6%。采用紫外分光光度法測(cè)定雙水相體系中上相的梔子黃含量，通過梔子黃的標(biāo)準(zhǔn)曲線和梔子黃色價(jià)的計(jì)算方法得到的梔子黃的色價(jià)是542，OD值是0.382。與通過部分傳統(tǒng)方法得到的梔子黃的色價(jià)和OD值相比，此色價(jià)和OD值較好。由此可以看出，ATPE可以用于梔子黃的提取。

圖3 HPLC分析a. crocin-1 reference substance； b. fraction into gardenia yellow after ATPEFig.3 HPLC chromatograms with UV detection at 440nm

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探究了梔子黃在異丙醇-檸檬酸三鈉體系中的分配情況。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在35℃條件下，1.6g檸檬酸三鈉和2mL的異丙醇，在pH=8.7的條件下，梔子黃更容易富集于上相，而多糖等雜質(zhì)則富集于下相。相比傳統(tǒng)的分離方法，異丙醇-檸檬酸三鈉雙水相萃取得到的梔子黃，具有很高的色價(jià)和OD值。

運(yùn)用此雙水相體系分離梔子黃，不僅降低了分離梔子黃的成本，還縮短了分離時(shí)間。該體系在分離梔子黃色素中的成功應(yīng)用，不僅拓寬了異丙醇-鹽雙水相體系的應(yīng)用范圍，也為梔子黃的分離提供了新的方法和思路。

［1]Ji-Hyun Park， Jaewoo Yoon， Ki Yong Lee， et al.Effects of geniposide on hepatocytes undergoing epithelial mesenchymal transition in hepatic fibrosis by targeting TGFβ/Smad and ERK-MAPK signaling pathways ［J］. Biochimie， 2015 （113）：26-34.

［2]Song Xiaojing， Guo Mengyao， Wang Tiancheng， et al. Geniposide Inhibited lipopoly-saccharide-induced Apoptosis by Modulating TLR4 and Apoptosisrelated Factors in mouse Mammary Glands［J］. Life Science， 2014， 119（1/2）：9-17.

［3]Liu Jianhui， Yin Fei， He Xiao， et al. Glucagon-like peptide receptor plays an essential role in geniposide attenuating lipotoxicity-induced β-cell apoptosis［J］. Tocicology in vitro， 2012， 26（7）： 1093-1097.

［4]Oh Oun Kwon， Eui Jin Kim， Jae Hyeok Lee， et al. Photovoltaic performance of TiO2electrode adsorbed with gardenia yellow purified by nonionic polymeric sorbent in dyesensitized solar cells［J］. Spectrochimical acta Part A： Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2015（136）： 1460-1466.

［5]李雄，陳茜文.梔子黃色素的二氧化碳超臨界萃取研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010 （1）：93-95.

［6]張德權(quán)，呂飛杰，臺(tái)建祥，等.超臨界CO2流體技術(shù)精制梔子黃色素的研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，1999，15（4）：226-230.

［7]蔣志國，陳文學(xué)，劉四新，等.低速逆流色譜分離制備梔子黃色素中的藏花素［J］.色譜，2011，29（3）：277-280.

［8]呂曉玲，姚中銘，姜平平.凝膠層析法精制梔子黃色素的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（4）：39-42.

［9]Natália Luiza Penna Dallora， Jo?o Gabriel Degam Klemz. Partitioning of model proteins in aqueous two-phase systems containing polyethylene glycol and ammonium carbamate［J］. Biochemical Engineering Journal， 2007（34）： 92-97.

［10]Mirjana G. Antov， Draginja M. Pericin， Milica G. Da?ic. Aqueous two-phase partitioning of xylanase produced by solid-state cultivation of Polyporus squamosus［J］.Process Biochemistry， 2006（41）： 232-235.

［11]Babak Mokhtarani， Ramin Karimzadch， Mohammad Hassan Amini， et al. Partitioning of ciprofloxacin in aqueous two-phase system of poly（ethylene glycol） and sodium sulphate［J］. Biochenical Engineering Journal， 2008（38）：241-247.

［12]I.-Horng Pan， Hsi-Ho Chiu， Chu-Hsun Lu， et al. Aqueous two-phase extraction as an effective tool for isolation of geniposide from gardenia fruit［J］. Journal of Chromatography A， 2002（977）： 239-246.

［13]Liu Hailing， He Chiyang， Wen Dawei， et al. Extraction of testosterone and epitestosterone in human urine using 2-propanol-salt-H2O system［J］. Analytica Chimica Acta， 2006， 57（1/2）： 329-336.

［14]Mohammed Taghi Zafarani-Moattar， Sepideh Banisaeid，Mohammad Ali Shamsi Beirami. Phase Diagrams of Some Aliphatic Alcohols+Potassium or Sodium Citrate+Water at 25℃［J］. Chem. Eng. Data.， 2005（50）： 1409-1413.

Abstrat：Gardenia yellow was separated by employing isopropanol-salt aqueous two-phase system. The factors such as kinds of salt，concentration of the salt， pH and temperture on the gardenia yellow separation efficiency were investigated， and the gardenia yellow was analyzed by spectrophotometric method and HPLC. The results showed that the aqueous two-phase system which was formed by isopropanol alcohol（2mL） and sodium citrate （1.6g）was effective for the separation of gardenia yellow from gardenia fruit in 35℃ and pH=8.7，and the color value and the OD of the gardenia yellow were 542 and 0.382，respectively.

Separation of Gardenia Yellow by Isopropanol Alcohol/Salt Aqueous Two-Phase System

GUO Jing-ying ，ZHANG Hong-ping
（Department of Chemistry and Biology Engineering， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China）

gardenia yellow； separation； aquous two phase system

TS 202. 3

A

1671-9905（2016）03-0007-05

邵陽市科技局科研項(xiàng)目（2015GX38）；邵陽學(xué)院研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2015SY035），

郭晶瑩（1987-），女，河南許昌人，邵陽學(xué)院2014級(jí)碩士研究生，研究方向：食品安全
通訊聯(lián)系人：張紅萍（1973-），女，漢族，湖南邵陽人，教授，主要從事有機(jī)合成研究。E-mail： zhp4901@163.com

2016-01-13