向本旭，孫芳玲，劉婷婷，艾厚喜，郭德玉，王宇峰，田　欣，祝自新，鄭文榮，王　文

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京　100053)

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研究報告

莫諾苷對缺血再灌注大鼠皮層TIMP表達(dá)的影響

向本旭，孫芳玲，劉婷婷，艾厚喜，郭德玉，王宇峰，田欣，祝自新，鄭文榮，王文

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京100053)

【摘要】目的研究莫諾苷對缺血再灌注7 d大鼠皮層中金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)表達(dá)的影響。方法25只雄性SD大鼠采用改良Zealonga線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，術(shù)后隨機(jī)分為模型組、莫諾苷小劑量組、中劑量組、大劑量組，每組5只。造模3 h后按30、90、270 mg/kg劑量每天一次灌胃莫諾苷。免疫印跡法(Western Blotting)和免疫熒光染色法(Immunofluorencent staining)分析莫諾苷對腦缺血再灌注7 d大鼠患側(cè)皮層TIMP表達(dá)的影響。結(jié)果腦缺血再灌注7 d后，與假手術(shù)組相比，模型組TIMP蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；同模型組相比，莫諾苷中劑量組(90 mg/kg)和大劑量組(270 mg/kg)TIMP蛋白表達(dá)均明顯升高(P < 0.05；P < 0.01)。結(jié)論莫諾苷可以上調(diào)TIMP在大腦皮層內(nèi)的表達(dá)，有助于腦卒中后血腦屏障的保護(hù)及修復(fù)。

【關(guān)鍵詞】莫諾苷；腦缺血再灌注；TIMP；血腦屏障保護(hù)及修復(fù)

在全球范圍內(nèi)，腦卒中是繼心臟病和癌癥之后的第三大致死疾??；在我國，腦卒中是致死率最高的疾病，同時我國是腦卒中患者最多的國家。據(jù)統(tǒng)計我國擁有超過700萬腦卒中患者，每年新增病例約150萬，死亡率是歐美國家的3～4倍，約為日本的3倍[1]。腦卒中后，由于血氧不足首先引起缺血局部的炎癥反應(yīng)，自由基增多[2]，再灌注后引發(fā)血腦屏障通透性增加[3]，同時神經(jīng)元大量死亡，膠質(zhì)細(xì)胞和微血管受損，血腦屏障逐步被破壞，最終導(dǎo)致缺血灶局部組織完全壞死[4]。在腦卒中急性期調(diào)節(jié)血腦屏障通透性，阻止血腦屏障通透性進(jìn)一步增加，保護(hù)血腦屏障完整性，從而保護(hù)神經(jīng)血管單元的功能完整性，防止損傷的進(jìn)一步增加，對腦卒中的治療和康復(fù)有著重要作用。

TIMP是體內(nèi)金屬基質(zhì)蛋白酶(metal matrix proteinases,MMPs)的自然抑制劑，兩者在體內(nèi)的相對含量決定了細(xì)胞基質(zhì)的降解速度。MMPs是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白酶，它們與血腦屏障的損傷密切相關(guān)。腦卒中發(fā)生后兩者激活，直接參與到血腦屏障的降解，促使血腦屏障開放，引起屏障破壞、通透性增加及二次損傷等[5]。TIMP能有效抑制MMPs的激活，降低腦卒中后由MMPs引起的血腦屏障破壞，通透性增加及進(jìn)一步損傷的發(fā)生，有助于腦卒中后血腦屏障的保護(hù)及修復(fù)，有助于神經(jīng)功能康復(fù)[6]。

莫諾苷是本課題組從山茱萸中提取的單體化合物，我們的前期研究已經(jīng)證明莫諾苷有抗氧化和抗凋亡的作用[7],動物實驗證明莫諾苷能有效減小大腦梗死體積，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)[8]。通過伊文思藍(lán)染色證明莫諾苷有助于腦缺血再灌注大鼠血腦屏障的保護(hù)[9]，另外我們還發(fā)現(xiàn)莫諾苷能有效降低腦卒中大鼠梗死周邊皮層中MMP-2和MMP-9的含量[10]。本研究中，我們對莫諾苷對腦卒中大鼠梗死周邊皮層中TIMP表達(dá)進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討莫諾苷對血腦屏障的保護(hù)機(jī)制，為腦卒中治療藥物的研究提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物分組及給藥

8周齡雄性SD大鼠50只，體重260～280 g，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供【SCXK(京)2011-0004】，動物飼養(yǎng)于宣武醫(yī)院實驗SPF級動物室【SYXK(京)2010-2013】，預(yù)適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實驗，環(huán)境溫度溫度 24±2℃，濕度55±5%，術(shù)前12 h禁食不禁水。采用線栓法制備局灶性大鼠腦缺血再灌注模型后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、莫諾苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、大(270 mg/kg)劑量組，共5組，每組10只。莫諾苷溶于蒸餾水，在MCAO造模3 h后，按照30、90、270 mg/kg劑量每天一次灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，假手術(shù)組和模型組給予等體積的蒸餾水。

1.2主要儀器和試劑

尼龍栓線，直徑0.26 mm(2636-100)：北京沙東生物技術(shù)有限公司；尼康eclipse 80i正置熒光顯微鏡：日本Niko公司；高分辨率多模式分子成像系統(tǒng)：美國Carestream Health 公司；全波長酶標(biāo)儀：美國 Thermo Fisher公司；超聲波細(xì)胞破碎粉碎機(jī)：JY92-II 型，寧波市新芝科技研究所；電泳儀和小型垂直電泳槽：美國Biorad 公司。

TIMP抗體：美國Abcam公司；山羊抗兔Alex Flour594免疫熒光二抗；山羊血清原液; 含DAPI封片劑：北京中杉金橋公司；生理鹽水；4%多聚甲醛灌注液；4%多聚甲醛后固定液；β-actin抗體：美國Santa Cruz公司?；衔锬Z苷，白色結(jié)晶，由宣武醫(yī)院藥物研究室自行從山茱萸中提取制備，高效液相色譜儀對組分進(jìn)行分析(C18柱，柱溫35℃，乙腈-水混合(15∶85)洗脫糖苷類，流速1.0 mL/min，檢測波長240 nm)，莫諾苷的純度為98.5%。

1.3MCAO模型制備及行為學(xué)評分

模型的制備參照Longa法[11]， SD雄性大鼠手術(shù)前禁食12 h。稱重后將體重在260～280 g之間的大鼠用7%水合氯醛400 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉。將麻醉后的大鼠用橡皮筋仰臥固定于手術(shù)操作臺上，用安爾碘對頸部進(jìn)行消毒。在大鼠頸部正中偏右約2～3 mm處縱向切口約1 cm后，對肌肉及筋膜進(jìn)行鈍性分離，注意避開甲狀腺及大血管。當(dāng)氣管右側(cè)及胸骨舌骨肌和胸鎖乳突肌之間的三角區(qū)暴露后，繼續(xù)鈍性分離出右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動脈(external carotid artery，ECA)。結(jié)扎ECA接近分叉處及 CCA近心端，用動脈夾夾閉ICA，在CCA用眼科剪剪一細(xì)小切口，將栓線小心插入，緩慢輕推栓線進(jìn)入ICA，從ICA與ECA分叉處插入20 mm深度為宜，則能通過 ICA入顱進(jìn)入了大腦中動脈(middle cerebral artery, MCA)，到達(dá)了大腦前動脈(anterior cerebral artery, ACA)起始部，阻斷MCA的所有血供，造成了大腦中動脈阻塞，此時不再推入栓線，以免扎破血管造成蛛網(wǎng)膜下腔出血。將栓線與CCA一并結(jié)扎，松開動脈夾，記錄栓塞開始時間?？p合肌肉，并在創(chuàng)口處涂少量青霉素，以預(yù)防傷口感染。栓塞30 min 后，用眼科鑷向外極緩慢拔出栓線，實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組大鼠不插入栓線，其余操作與MCAO手術(shù)組相同。

MCAO手術(shù)以后注意保溫，大鼠麻醉未醒之前應(yīng)置于溫控毯上，動物清醒后觀察其行為。采用Longa 5分評分法進(jìn)行術(shù)后行為學(xué)評分[12]：0分，正常，無神經(jīng)功能缺損；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，行走時，向?qū)?cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)大圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分，行走時，向?qū)?cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)小圈；4分，行走時，向?qū)?cè)(癱瘓側(cè))傾斜，重度神經(jīng)功能缺損；5分，不能自發(fā)行走，有意識喪失。評分1～4分為造模成功，0分和5分淘汰。采用差額補(bǔ)充方法補(bǔ)足各組設(shè)計所需大鼠數(shù)量。以上動物實驗操作均在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實驗動物室進(jìn)行，并按實驗動物3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.4 免疫熒光染色分析TIMP蛋白在半暗帶表達(dá)

于造模后7 d將大鼠用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于鼠板，迅速剪開大鼠胸腔。將灌注用鈍型針頭從心尖插入左心室至主動脈弓，迅速用止血鉗夾住心臟與灌注針頭，然后依次緩慢推入200 mL生理鹽水與多聚甲醛灌注液，至大鼠四肢伸展僵硬。將灌注好的大鼠放置1 h后剝離大腦并放入后固定液中待用。

對于近年開展的“送培下鄉(xiāng)”活動，我們通過座談方式了解到：我們主動送課到鄉(xiāng)，為學(xué)員節(jié)約了培訓(xùn)時間和培訓(xùn)成本，切實幫助他們?nèi)〉昧死^續(xù)教育合格證書、普通話和電腦等級證書等，這一系列舉措已獲得學(xué)員好評。但我們通過問卷形式對送培活動參與者展開的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我們的培訓(xùn)活動中還存在一些比較突出的問題：1.農(nóng)村學(xué)校教師工學(xué)矛盾沖突，學(xué)習(xí)積極性普遍不高。2.多學(xué)科混合的單一課程內(nèi)容不能滿足教師的培訓(xùn)需求。3.培訓(xùn)機(jī)構(gòu)只管送的過程而不顧送的結(jié)果，教師的真實問題沒有得到解決。4.教學(xué)設(shè)施和條件已不能滿足教學(xué)基本要求。

將多聚甲醛固定好的大腦進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為20 μm，選取合適腦片進(jìn)行免疫熒光染色。首先將腦片用10%山羊血清(0.1%PBS稀釋)封閉1 h以去除非特異性抗原，然后用0.1%PBS洗液將腦片洗滌3次，每次10 min。吸出PBS洗液后，加入1∶200稀釋的兔抗大鼠TIMP單克隆抗體于室溫?fù)u晃2 h后放于4℃冰箱內(nèi)至少8 h?？贵w孵育8 h后，再次用PBS洗液對腦片洗滌3次，每次10 min。再避光加入1∶200 PBS稀釋的山羊抗兔Alex Flour594免疫熒光二抗，室溫孵育2 h后再用PBS洗滌3次，每次10 min。洗滌完成后，將腦片貼于載玻片上，避光風(fēng)干后滴加封片液加蓋玻片封片。

將封好的腦片用尼康eclipse 80i正置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，將拍好的圖片用光盤拷出待分析，實驗重復(fù)3次。

1.5Western-blot分析TIMP蛋白表達(dá)

于造模后7 d將大鼠用10%水合氯醛400 mg/kg 腹腔注射麻醉，迅速剝離大腦并將腦膜剝?nèi)?，取出患?cè)皮層包入錫箔紙中，暫時放入液氮中凍存，后置于-80℃保存。取出患側(cè)皮層于5 mL EP管中稱重，加入預(yù)冷的裂解液7 μL/mg新鮮組織、PMSF1 μL/100 μL RIPA，冰浴粉碎機(jī)粉碎后超聲粉碎。4℃靜止30 min，4℃ 12000 r/min離心30 min，取上清液。采用BCA法定量蛋白濃度，并加入裂解液,調(diào)節(jié)各組總蛋白濃度一致。總蛋白加入5X上樣緩沖液1∶4稀釋，95℃變性10 min。

取大鼠患側(cè)皮層腦組織裂解提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每孔加入10 μL樣品，先恒壓60V電泳45 min；然后恒壓90V電泳至分離膠底部，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1000稀釋的兔抗大鼠TIMP單克隆抗體于室溫?fù)u晃2 h后放于4℃冰箱內(nèi)至少10 h。TIMP抗體孵育10 h后，用TBST對膜洗滌3次，每次10 min，再加入1∶2000稀釋的羊抗兔IgG-HRP，室溫?fù)u床孵育2 h，然后用TBST洗滌3次，ECL試劑顯色、曝光并拍照，以β-actin作為內(nèi)參，實驗重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果

2.1行為學(xué)評分

注：(A)大鼠在MCAO造模0 d和7 d各組神經(jīng)功能評分結(jié)果：*P < 0.05, **P < 0.01與術(shù)后7 d模型組相比(n=10)；(B)免疫熒光檢測梗死半暗帶TIMP表達(dá)，a：假手術(shù)；b：模型組；c：莫諾苷小劑量組；d：莫諾苷中劑量組；e：莫諾苷大劑量組；(C)TIMP在半暗帶陽性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果：#P < 0.05與假手術(shù)相比；*P < 0.05,**P < 0.01與模型組相比(n=5)。圖1　A：術(shù)后神經(jīng)功能評分結(jié)果；B：TIMP免疫熒光染色結(jié)果(標(biāo)尺=50 μm)；C：TIMP陽性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果Note：(A)The modified neurological severity score (mNss) of rats on 0 day and 7 days after MCAO:*P < 0.05, **P < 0.01 compared with MCAO group on 7 days after operation (n=10);(B) The expression of TIMP in ischemic penumbra detected by immunofluorescent staining, a: sham group; b: MCAO group; c: morroniside low-dose group; d: morroniside middle-dose group; e: morroniside high-dose group;(C) The statistic result of the number of positive TIMP cells in penumbra: #P<0.05 compared with sham group; *P < 0.05 and **P < 0.01 compared with MCAO group (n=5).Fig.1　A: mNss score of rats on 0 day and 7 days after MCAO; B: Immunofluorescent staining of TIMP(Bar=50 μm); C: The statistic result of positive TIMP cells.

2.2TIMP免疫熒光染色結(jié)果

我們利用免疫熒光染色實驗觀察TIMP在缺血性腦卒中大鼠梗死周邊表達(dá)。如圖1(B)所示：大鼠缺血再灌注損傷7 d后，其梗死半暗帶TIMP表達(dá)相對于假手術(shù)組有升高，說明缺血性腦損傷誘導(dǎo)了血腦屏障重構(gòu)，缺血皮層中TIMP應(yīng)激性升高以維持與MMPs的平衡；而莫諾苷給藥后，大鼠缺血半暗帶中TIMP表達(dá)相對于模型組也有增多，說明莫諾苷能促進(jìn)半暗帶中TIMP含量。對半暗帶統(tǒng)計結(jié)果如圖1(C)所示：術(shù)后7 d，模型組梗死半暗帶中TIMP陽性細(xì)胞數(shù)目較假手術(shù)組有增多(P< 0.05)；莫諾苷給藥后，小劑量組相對于模型組半暗帶中TIMP陽性細(xì)胞數(shù)目增多(P< 0.05)；中劑量和大劑量則有顯著增多(P< 0.01)。

2.3Western Blotting 對缺血皮層TIMP表達(dá)檢測

Western Blotting對各組大鼠缺血側(cè)皮層中TIMP表達(dá)量進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖2中A圖所示。對各組大鼠缺血側(cè)皮層中TIMP相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果如圖2中B圖所示：模型組TIMP蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組有顯著升高(P< 0.01)，這與免疫熒光染色的結(jié)果相一致；與模型組相比，中劑量組與大劑量較模型組有顯著升高(P< 0.05;P< 0.01)，莫諾苷小劑量組表達(dá)水平與模型組相比有升高趨勢，但無顯著性差異。表明莫諾苷能有效促進(jìn)缺血性腦損傷后TIMP升高，有利于血腦屏障的保護(hù)。

注：(A)各組大鼠缺血側(cè)皮層TIMP表達(dá)水平；(B)各組大鼠缺血側(cè)皮層TIMP相對表達(dá)定量結(jié)果。與假手術(shù)相比，##P < 0.01；與模型組相比，*P < 0.05，**P < 0.01。圖2　TIMP在各組表達(dá)水平Note : (A) The expression level of TIMP in ischemic hemisphere of rats in all groups; (B) The relative expression quantitative level of TIMP in ischemic hemisphere of rats in all groups. Compared with sham group, ##P < 0.01; Compared with MCAO group, *P < 0.05 and **P < 0.01.Fig.2　TIMP expression level of TIMP in groups

3討論

腦卒中發(fā)生后2 h內(nèi)缺血灶可檢測到MMPs表達(dá)增高[13]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注損傷后，其缺血側(cè)皮層梗死周邊區(qū)域MMP-2與MMP-9表達(dá)均上調(diào)[14]，這與大量研究證明的MMP-2在缺血再灌注早期引起血腦屏障開放[15]，MMP-9與血腦屏障二次開放引發(fā)損傷有關(guān)[16]相一致。TIMP作為MMPs的自然抑制劑，通過與MMPs結(jié)合從而降低MMPs在體內(nèi)活性來發(fā)揮作用。在腦卒中發(fā)生后，TIMP能抑制MMPs的活性，在一定程度上阻止MMPs對基底膜的破壞和降解，從而保持血腦屏障的完整性。

本研究顯示，莫諾苷能有效降低腦缺血再灌注7 d后神經(jīng)功能損傷，有助于中風(fēng)大鼠神經(jīng)功能康復(fù)，通過免疫熒光和免疫印跡的方法確定了腦缺血再灌注損傷7 d后，大鼠缺血側(cè)皮層TIMP表達(dá)量上調(diào)，這與已有報道一致[17]，可能與TIMP-MMPs平衡的自我調(diào)節(jié)有關(guān)。結(jié)果顯示，莫諾苷能進(jìn)一步誘導(dǎo)梗死側(cè)皮層中TIMP增多，前期研究已經(jīng)證明莫諾苷能降低大鼠腦缺血再灌注損傷7 d后梗死周邊MMP-2和MMP-9表達(dá)，減小了血腦屏障的破壞[10]，結(jié)合兩實驗結(jié)果證明在莫諾苷能通過增高腦缺血再灌注后TIMP表達(dá)且降低MMPs表達(dá)量，從而有效降低MMPs誘導(dǎo)的血腦屏障破壞，有利于腦卒中的康復(fù)。

此外，臨床針對腦卒中主要通過在治療時間窗內(nèi)進(jìn)行r-tPA溶栓，時間窗外溶栓則有較高的再灌注損傷風(fēng)險，現(xiàn)已有實驗證明TIMP可降低時間窗外r-tPA溶栓造成的再灌注損傷[18]。 莫諾苷在腦缺血再灌注后能增加內(nèi)源性MMPs自然抑制劑TIMP的表達(dá)，從而在避免了大腦在低氧、炎癥等狀態(tài)下由MMPs誘導(dǎo)的血腦屏障的破壞及其二次開放等損傷，這對腦卒中的治療是有意義的。

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〔修回日期〕2015-12-25

[基金項目]“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2012ZX09102201-106)；國家自然科學(xué)基金(81373994，81503049，81573633)。

[作者簡介]向本旭(1990-)，男，碩士生，研究方向：神經(jīng)藥理。E-mail: xiangbenxu@126.com。 [通訊作者]王文(1968-)，男，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理，中藥藥理。E-mail: lzwwang@163.com。

【中圖分類號】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 01-0001-06

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.001

Effects of morroniside on the expression of the TIMP in peri-infarct cortex after cerebral ischemia-reperfusion in rats

XIANG Ben-xu，SUN Fang-ling，LIU Ting-ting，AI Hou-xi，GUO De-yu, WANG Yu-feng， TIAN Xin, ZHU Zi-xin, ZHENG Wen-rong，WANG Wen

(Xuan Wu Hospital of Capital Medical University, Beijing 100053, China)

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of morroniside on the expression of the tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) of the ischemic ipsilateral cortex 7 days after ischemia reperfusion. Methods25 male Sprague-Dawley rats were subjected to middle cerebral artery occlusion (MCAO) model with modified Zea Longa’s method, and then divided them into sham group (n=5), ischmia group (n=5), and morroniside groups (low, medium, and high dosage groups, n=5) randomly. Morroniside were then administered intragastrically once a day at dose of 30 mg/kg, 90 mg/kg and 270 mg/kg 3 hours after operation. The expression of TIMP of the ischemic ipsilateral cortex on 7 days after ischemia-reperfusion were detected by western blotting and immunofluorescent staining analysis. ResultsCompared with the sham group, the expression of TIMP in ischemia group increased (P<0.05) 7 days after MCAO. Compared with the ischemia group, after treatment with morroniside at doses of 90 mg/kg and 270 mg/kg, the expression of TIMP increased significantly (P < 0.05; P<0.01). ConclusionsMorroniside could increase the expression of TIMP in the ischemic ipsilateral cortex and may contribute to blood-brain barrier protection and restoration.

【Key words】Morroniside; Cerebral ischemia-reperfusion; TIMP; Blood-brain barrier protection and restoration