董金香鄧　毅，2*劉　靚趙　妮曼　瓊吳國(guó)俠楊志軍（.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)　蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　蘭州　730000）

甘肅野生甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)LPS致raw264.7分泌炎癥因子的影響△

董金香1鄧毅1，2*劉靚1趙妮1曼瓊1吳國(guó)俠1楊志軍1（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蘭州730000）

摘要：目的：研究甘肅野生甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)LPS刺激的raw264.7細(xì)胞炎癥模型分泌炎癥因子的調(diào)節(jié)作用。方法：采用Griess法、ELISA法檢測(cè)甘肅野生甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵液與宿主水煎液、總黃酮提取物、總皂苷提取物對(duì)LPS刺激raw264.7細(xì)胞分泌NO、TNF-α、IL-6含量。結(jié)果：經(jīng)LPS刺激后，與模型組相比，野生甘草的水煎液和野生甘草的總黃酮、總皂苷以及其有效菌株的發(fā)酵液均能抑制NO、TNF-α、IL-6的分泌（P＜0.05）。結(jié)論：甘草內(nèi)生菌JTYB018、JTYF027的發(fā)酵液有抑制raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的作用。

關(guān)鍵詞：甘草 raw264.7內(nèi)生菌 總黃酮 總皂苷 抗炎

甘草，補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥，由于療效好、作用廣，素有“中草藥之王”的美譽(yù)。植物內(nèi)生菌（endophyte）是指生活在健康植物組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，不會(huì)使宿主植物致病，是宿主植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中衍生出的一類微生物，與宿主植物相互影響能產(chǎn)生與其相同或相似的作用成分。又有研究發(fā)現(xiàn)，甘草總黃酮［1～3］和甘草總皂苷［4］有不同途徑的抗炎作用，考慮其內(nèi)生菌是否能產(chǎn)生甘草總黃酮、甘草總皂苷或與其相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)從而取代甘草，為解決植物甘草的大量需求，緩解資源瀕臨滅絕的危機(jī)，本實(shí)驗(yàn)從甘草的抗炎作用方面著手探究，比較觀察5株有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體外抗炎的效果。

1材料

1.1藥品：甘肅省酒泉市金塔縣野生烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch。

1.2試劑：raw264.7，LPS，DMEM培養(yǎng)基，血清，青霉素-鏈霉素溶液，PBS，乙醇，氨水，濃鹽酸，馬鈴薯葡萄糖水（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基HB0233）營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA，青島高科園海博生物技術(shù)，營(yíng)養(yǎng)肉湯）一氧化氮檢測(cè)試劑盒（TNF-α試劑盒，IL-6試劑盒）。

1.3儀器：超凈工作臺(tái)（天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：CJ-2S），9082-B型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（SHEL L/JB），醫(yī)用低速離心機(jī)（金壇市恒豐儀器廠，LXJ-802），全溫?fù)u床柜（IKA-KS 4000i control），倒置顯微鏡（Ti-nikon），LDZX-30FB立體壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），酶標(biāo)儀。

2方法

2.1內(nèi)生菌發(fā)酵液的制備和有效菌株的篩選：將野生甘草內(nèi)生菌分離純化培養(yǎng)［5］，最終從野生甘草中分離出63株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細(xì)菌31株（JTYB001、JTYB002、JTYB003…JTYB031），內(nèi)生真菌32株（JTYF001、JTYF002、JTYF003…JTYF032）；在無(wú)菌操作臺(tái)中，從已活化好的NA、PDA平板培養(yǎng)基挑取2環(huán)菌餅于

250mL裝有100mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的搖瓶中，分別以28℃、170r/min的搖床上震蕩培養(yǎng)4d、7d，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)6層紗布過濾，放于蒸發(fā)皿中，在水浴鍋調(diào)至70℃蒸干至浸膏，分別稱取10mg，用DMEM培養(yǎng)基定容至5mL，即得2mg/mL的母液，備用。測(cè)其對(duì)LPS致raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6炎癥因子量的影響，從而篩選出有效的菌株。2.2甘草水煎液的制備：野生甘草破碎至1～3mm長(zhǎng)度，取10g加100mL水，浸泡30min，武火加熱，文火煎煮60min，4層紗布過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸干至浸膏，稱取4g，用DMEM 2mL稀釋，得到2mg/mL的母液，于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3甘草總黃酮和總皂苷制備：在乙醇濃度80%，料液比1∶10和40℃的條件下，超聲提取40min。將提取液濃縮，加氨水直至溶液為堿性，用乙酸乙酯萃取4次，濃縮至固體，即得甘草總黃酮，紫外分光法測(cè)得其含量為75%。收集下層萃取液，加鹽酸至pH 為1～2，冰箱靜置，使甘草總皂苷充分沉淀，離心，取沉淀，干燥至恒重，即得甘草總皂苷，紫外分光法測(cè)得其含量為45%［6］。

2.4細(xì)胞培養(yǎng)與儲(chǔ)存：將raw264.7放于含10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至實(shí)驗(yàn)所需量，再將5～10支細(xì)胞株凍存在-80℃超低溫冰箱，隔夜后永久保存在液氮中。

2.5采用Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO的含量：用Griess法檢測(cè)內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)LPS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)物的抑制作用，取指數(shù)生長(zhǎng)期raw264.7配制成細(xì)胞懸液，分別以1×106個(gè)/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)液，每孔加100μL不完全培養(yǎng)基，饑餓4h吸棄?？瞻捉M加完全培養(yǎng)基200μL，LPS組加100μL完全培養(yǎng)基和100μL（20μg/mL）LPS，終濃度為10μg/mL；實(shí)驗(yàn)組加入100μL LPS（20μg/mL）和JTYB0028、JTYF027的樣品母液，終濃度為10μg/mL，每個(gè)樣品有6個(gè)復(fù)孔，干預(yù)24h。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、LPS陽(yáng)性對(duì)照組、LPS加JTYB028組、LPS加JTYF027組，48h后檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO的含量，按照Griess試劑盒說明書操作。

2.6雙抗體夾心ELISA實(shí)驗(yàn)：方法同“2.5”，實(shí)驗(yàn)組加入100μL LPS（20μg/mL）和100μL的JTYB018、JTYF027樣品母液，終濃度為10μg/mL，具體操作按照試劑盒說明書。

3結(jié)果

各有效菌株發(fā)酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的影響，結(jié)果見表1。

表1各樣品溶液對(duì)raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的影響（±s）（n=6）

表1各樣品溶液對(duì)raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的影響（±s）（n=6）

注：JTYB：野生甘草內(nèi)生細(xì)菌，JTYF：野生甘草真菌

組別（10μg/mL）　NO濃度/（μmol/L）　TNF-α濃度/（pg/mL）　IL-6濃度/（pg/mL）空白組3.18±2.21**　193.38±86.30**　10.76±5.69**模型（LPS）組　14.28±2.10　2803.46±343.43　3031.06.±796.50野生甘草水煎液組　8.14±3.247**　1783.12±220.71**1443.23±569.68**野生甘草總黃酮組　5.65±2.44**　1700.52±124.23**1482.89±510.15**野生甘草總皂苷組　5.35±2.32**　1911.18±508.01**1704.85±449.34**JTYB018　7.75±2.79**　1502.21±334.23**☆　1594.47±320.83**JTYF027　6.99±1.83**　1620.84±502.54**1519.76±490.74**

與模型組比較**P＜0.05；與野生甘草總皂苷組比較☆P＜0.05。

結(jié)果表明，在LPS刺激下，模型組細(xì)胞釋放的NO、TNF-α、IL-6濃度高于空白組（P＜0.05），造模成功。與模型組相比，野生甘草水煎液、野生甘草總黃酮、野生甘草總皂苷和野生甘草各有效菌株對(duì)炎癥模型Raw264.7炎癥因子的分泌均有抑制作用（P＜0.05）；與野生甘草水煎液組、野生甘草總黃酮組、野生甘草總皂苷組相比，JTYF027無(wú)差異，表明其抑制作用無(wú)差異；JTYB018的TNF-α分泌量與野生甘草總皂苷比較；強(qiáng)于野生甘草總皂苷組（P＜0.05）；JTYB018的NO和IL-6分泌與野生甘草水煎液組、野生甘草總黃酮組、野生甘草總皂苷組相比無(wú)差異。

4討論

LPS是革蘭氏陰性菌的主要致病成分，成為現(xiàn)代體外實(shí)驗(yàn)常用的造模用藥。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到外界抗原刺激時(shí)（如內(nèi)毒素）便會(huì)釋放一氧化氮（NO）、白介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF）等重要的炎癥細(xì)胞因子，它們均可促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織損傷。本實(shí)驗(yàn)中，通過觀察LPS誘導(dǎo)炎癥因子NO、TNF-α、IL-6的分泌量判斷體外炎癥模型造的成功與否。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以得出野生甘草水煎液、野生甘草總黃酮和野生甘草總皂苷組抑制炎癥因子分泌作用與JTYF027對(duì)NO、TNF-α、IL-6分泌的作用無(wú)差異，而JTYB018的抑制TNF-α作用還高于野生甘草總皂苷組，其他亦無(wú)差異。我們假想菌株的代謝產(chǎn)物中可能含有與甘草藥效成分相關(guān)的物質(zhì)。本課題后續(xù)部分，我們將思考大批量生產(chǎn)發(fā)酵液，并從發(fā)酵液中進(jìn)行成分的提取分離方面的研究，考慮是否有與植物甘草提取的成分相關(guān)或相似的物質(zhì)，從而為解決甘草資源逐漸緊缺問題奠定基礎(chǔ)。

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中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1672-8351（2016）07-0137-02

基金項(xiàng)目：△國(guó)家自然基金：甘草內(nèi)生菌有效菌株代謝產(chǎn)物與甘草藥效成分的相關(guān)性研究，編號(hào)81360633。

*通訊作者