吳　瓊　王均明　伍蔚萍（浙江燎原藥業(yè)股份有限公司　臨海　317016）

HPLC法測(cè)定鹽酸度洛西汀原料藥中的甲醛含量

吳瓊王均明伍蔚萍（浙江燎原藥業(yè)股份有限公司臨海317016）

摘要：目的：建立測(cè)定鹽酸度洛西汀原料藥中甲醛含量的HPLC方法。方法：利用甲醛可與1，4-二硝基苯肼反應(yīng)生產(chǎn)甲醛2，4-二硝基苯腙的衍生物的原理，對(duì)甲醛衍生物采用HPLC分析，色譜條件：色譜柱為Agilent XDB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（60∶40，V/V），等度洗脫；流速1.0mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。結(jié)果：甲醛衍生物與待測(cè)樣品中未知峰能分開，甲醛檢測(cè)限約為0.4ppm。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏、穩(wěn)定可靠，可用于鹽酸度洛西汀原料藥中甲醛含量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：甲醛 含量 鹽酸度洛西汀 HPLC

鹽酸度洛西汀，化學(xué)名為（S）-（+）-N，N-二甲基-3-（1-萘氧基）-3-（2-噻吩）-丙胺鹽酸鹽，主治抑郁癥。在鹽酸度洛西汀的生產(chǎn)過(guò)程中使用了甲醛溶劑，由于甲醛對(duì)人體有危害，已被世界衛(wèi)生組織確定為致癌和致畸形物質(zhì)，需要嚴(yán)格控制甲醛在原料藥中的殘留量。根據(jù)鹽酸度洛西汀的日劑量，企業(yè)初步確定對(duì)甲醛的限度規(guī)定為20ppm。從葛興等［1］對(duì)甲醛的幾種測(cè)定方法概述中，了解到對(duì)甲醛含量的測(cè)定方法有分光光度法、色譜法、電化學(xué)法以及化學(xué)滴定法。在這幾種方法中，色譜法以專屬性、靈敏度高有較大優(yōu)勢(shì)。陳建芬等［2］利用高效液相色譜法對(duì)口腔護(hù)理產(chǎn)品中的甲醛進(jìn)行研究，曹國(guó)華等［3］采用高效液相色譜法測(cè)定了鹽酸四環(huán)素原料藥中甲醛含量，筆者借鑒了上述采用高效液相色譜法測(cè)定甲醛殘留的文獻(xiàn)以及USP35版鹽酸噻氯匹定［4］的甲醛含量測(cè)定方法，即利用2，4-二硝基苯肼在酸性條件下可與含有甲醛的樣品反應(yīng)，生成甲醛2，4-二硝基苯腙衍生物后，在360nm波長(zhǎng)下，對(duì)其衍生物用HPLC進(jìn)行分析，從而獲得甲醛含量方法。通過(guò)試驗(yàn)證明，該方法專屬、穩(wěn)定、可靠。

1實(shí)驗(yàn)材料

Agilent 1200（包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測(cè)器、Chemistation色譜工作站）；XS205型電子天平（梅特勒-托利多公司）。

甲醛水溶液（含量為37.3%，ACS級(jí)別）、鹽酸度洛西汀樣品（浙江燎原藥業(yè)有限公司）；2，4-二硝基苯肼（99.6%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醛2，4-二硝基苯腙（98%，TCI）；甲醇、乙腈（色譜純，天津康科德科技有限公司）。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1稀釋液：流動(dòng)相A:流動(dòng)相B=50∶50（V∶V）。

2.1.2 2N鹽酸溶液：取9mL鹽酸加水稀釋成50mL，即得。

2.1.3 2，4-二硝基苯肼溶液：稱取82.5mg的2.4-二硝基苯肼置于50mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，混勻，即得。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取甲醛水溶液（37.3%）500mg置于100mL量瓶中，精密稱定，用甲醇稀釋至刻度，混勻。

2.1.5標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取1.0mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置于100mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻；再移取1.0mL上述稀釋過(guò)的溶液置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，獲得甲醛濃度為1.85μg/mL。

2.1.6樣品溶液：取鹽酸度洛西汀供試品約0.50g，精密稱定，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻。（若有必要可超聲使樣品完全溶解?。?/p>

2.1.7衍生空白溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N鹽酸溶液至此量瓶中，再移取270μL甲醇至此量瓶中，搖勻，室溫下放置反應(yīng)40min［4］，再加稀釋液至刻度，混勻，即得。

2.1.8衍生標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N鹽酸溶液至此量瓶中，再移取270μL標(biāo)準(zhǔn)溶液至此量瓶中，搖勻，室溫下放置反應(yīng)40min，再加稀釋液至刻度，混勻，即得。

2.1.9衍生樣品溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N鹽酸至此量瓶中，再移取270μL供試品溶液至此量瓶中，搖勻，室溫下放置40min，再加稀釋液至刻度，混勻，即得。

2.1.10甲醛2，4-二硝基苯腙溶液：稱取約50mg的甲醛2，4-二硝基苯腙，置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻；再移取此溶液1.0mL至100mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，獲得濃度約為5μg/mL的溶液。

2.1.11加樣混合溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液置一10mL量瓶中，再取50μL的2N鹽酸溶液至此量瓶中，再移取270μL供試品溶液和270μL標(biāo)準(zhǔn)溶液至此量瓶中，搖勻，室溫下放置反應(yīng)40min，再加稀釋液至刻度，混勻，即得。

注：各衍生溶液應(yīng)在配制好的4h內(nèi)進(jìn)樣分析［4］。

2.2色譜條件：Agilent XDB C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（60∶40，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；流速：1.0mL· min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；運(yùn)行時(shí)間：38min。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性：確認(rèn)空白溶劑其他雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰的測(cè)定干擾。取衍生空白溶液、衍生標(biāo)準(zhǔn)溶液、甲醛2，4-二硝基苯腙溶液、加樣混合溶液進(jìn)樣測(cè)定，圖譜分別見圖1～圖4。

從圖1看出，空白溶液在目標(biāo)峰甲醛-2.4二硝基苯腙的位置有干擾，估計(jì)由試劑2，4-二硝基苯肼試劑本身帶入而無(wú)法消除，因此在計(jì)算甲醛含量時(shí)，需要扣除空白值。

從圖2和圖3可以看出，衍生標(biāo)準(zhǔn)溶液的甲醛衍生物與甲醛2，4-二硝基苯腙的峰保留時(shí)間一致，所以判斷RT約10.6min峰是甲醛衍生物即甲醛2，4-二硝基苯腙的色譜峰。從圖4加樣混合溶液色譜圖可看出，樣品中其他雜質(zhì)峰并未干擾目標(biāo)峰甲醛-2.4二硝基苯腙，目標(biāo)峰與后面的一小峰（來(lái)源于空白溶液峰）的分離度也能達(dá)到1.5，表明該方法專屬性良好。

2.3.2檢測(cè)限（LOD）：按照信噪比為3∶1的要求配制目標(biāo)峰的檢測(cè)限溶液（具體配制過(guò)程：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N鹽酸溶液至此容量瓶中，再移取3μL標(biāo)準(zhǔn)溶液至此量瓶中，搖勻，室溫下放置反應(yīng)40min，再加稀釋液至刻度，混勻，即得）。檢測(cè)限溶液須連續(xù)進(jìn)樣3針，從Agilent Chemstation工作站圖譜數(shù)據(jù)獲得3次進(jìn)樣的信噪比（S/N）分別為3.4，3.5，2.9，其平均值為約3.3，對(duì)應(yīng)的甲醛LOD值約為0.4ppm，對(duì)于甲醛要求的限度20ppm來(lái)說(shuō)，此檢測(cè)靈敏度滿足要求。

2.4樣品測(cè)定：取3批鹽酸度洛西汀樣品，按“衍生樣品溶液”方法操作制備溶液，每批樣品平行制備2份，每份測(cè)定1次，記錄色譜圖，具體結(jié)果見表1。

甲醛含量計(jì)算方式：要求各衍生樣品溶液中甲醛2，4-二硝基苯腙的峰面積（AU）不得超過(guò)衍生標(biāo)準(zhǔn)溶液中此峰面積的一半（AS/2），即對(duì)應(yīng)甲醛的限度不得大于20ppm。

具體結(jié)果見表1。

表1 3批樣品中甲醛的檢測(cè)結(jié)果

3討論

3.1吸收波長(zhǎng)的確定：參照陳建芬等［2］提供的甲醛衍生物的紫外吸收光譜圖看到最大吸收波長(zhǎng)在360nm處左右，因此直接選定360nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2由于考慮到甲醛在成品鹽酸度洛西汀中含量非常低，檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)低于接受標(biāo)準(zhǔn)的10%水平，企業(yè)在日常檢測(cè)中無(wú)需對(duì)此雜質(zhì)進(jìn)行控制，進(jìn)行周期性控制即可。

3.3因?yàn)楸緳z測(cè)方法屬于雜質(zhì)限量控制，按照ICH Q2［5］以及《中國(guó)藥典》附錄9101［6］等對(duì)分析方法驗(yàn)證指南，對(duì)雜質(zhì)限量檢測(cè)方法驗(yàn)證，方法學(xué)考察專屬性和檢測(cè)限即可。

參考文獻(xiàn)

［1］葛興，鄭燕英，羅蒨.甲醛的幾種測(cè)定方法［J］.大眾科技，2004，11：18-20.

［2］陳健芬，施裔磊.高效液相色譜法分析口腔護(hù)理產(chǎn)品中甲醛含量的研究［J］.口腔護(hù)理用品工業(yè)，2013，23（6）：12-15.

［3］曹國(guó)華，鄭劍萍，杜瑋，等.柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定鹽酸四環(huán)素原料藥中微量甲醛含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2015，24（6）：42-44.

［4］USP35:Ticlopidine Hydrochloride.

［5］ICH Q2（R1）：Validation of Analytical procedures:Text and Methodology.

［6］2015版中華人民共和國(guó)藥典四部通則：9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則.

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-8351（2016）07-0014-02