張　婷,龍　艷,張緒富,胡貴方，戴迎春

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我國GII.4型諾如病毒Sydney株P(guān)顆粒的表達(dá)及其組織血型抗原結(jié)合特征

張婷1,龍艷2,張緒富2,胡貴方1，戴迎春1

1.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院，廣州510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州510515

摘要：目的表達(dá)我國新發(fā)現(xiàn)GII.4型諾如病毒優(yōu)勢流行株—Sydney株的P顆粒，并探究其結(jié)合人類組織血型抗原(HBGAs)受體特征及變化規(guī)律。方法擴(kuò)增SH 2012_05株中的P區(qū)域序列，構(gòu)建進(jìn)化樹分析其氨基酸序列，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)P顆粒。目的重組蛋白經(jīng)Western blot確定其特異性，并采用ELISA法檢測P顆粒結(jié)合HBGAs的能力及方式。結(jié)果SH 2012_05毒株 P區(qū)域與Sydney/2012原型株同源性為99.1%，為GII.4/Sydney基因簇。SDS-PAGE電泳和Western blot分析驗(yàn)證SH 2012_05株P(guān)顆粒具有特異性。其結(jié)合HBGAs受體方式與以往流行的基因簇一致，即與A、B、O、AB型分泌型唾液均能結(jié)合，其中與B型抗原親和力最高。結(jié)論成功表達(dá)了我國新發(fā)現(xiàn)GII.4型諾如病毒Sydney株的P顆粒，明確了Sydney株能結(jié)合分泌型HBGAs受體的特征。本研究為諾如病毒疫苗株選擇提供了技術(shù)儲備，這將為GII.4型諾如病毒的預(yù)防和控制提供科學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：諾如病毒；GII.4型；Sydeny株；P顆粒；人類組織血型抗原

Supported by the Natural Science Foundation of China (No. 81473402), the Nature Science Foundation of Guangdong Province (No. 2014A030313332), and the 10th Presidential Foundation of School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University (No. GW201503)

Correspondence authors:Hu Gui-fang,Email:guif-hu@sina.com；Dai Ying-chun, Email: yingchun78@hotmail.com.

諾如病毒(Norovirus, NoV)具有基因多樣性，分為5個不同的基因型GI-GV，其中GII.4型是全球優(yōu)勢流行株，每隔1～3年就有新的GII.4變異株出現(xiàn)，包括95/96US株(1995-1996年)、Farmington Hills株(2002-2004年)、Hunter株(2004-2006年)、2006a株和2006b株、Osaka株(2007年)New Orleans株(2009年)和Sydney株(2012年)。NoV以株別特異性的方式識別人組織血型抗原(Histo-blood antigens,HBGAs)[1-2],HBGAs是一類復(fù)合糖，不僅存在于血細(xì)胞、腸道粘膜細(xì)胞表面，也以游離的形式存在于乳汁、唾液中。NoV與HBGAs抗原結(jié)合模式主要分為3組：H抗原、A/B抗原和Lewis抗原結(jié)合模式[3-4]。

自2012年9月起，歐洲NoV監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)全球NoV胃腸炎患者呈現(xiàn)大幅度上升，經(jīng)過后期基因分析證實(shí)，NoV胃腸炎的暴發(fā)增加與一種新型GII.4型變異株有關(guān)，該變異株被命名為Sydney株。GII.4型Sydney變異株首先在丹麥等地的散發(fā)病例中發(fā)現(xiàn)，隨后引起疫情暴發(fā)造成世界范圍內(nèi)的大流行[5]。2012年底至2013年初，我國北京、香港、廣州、江蘇省等地區(qū)均有GII.4型Sydney株的流行[6-9]。本研究表達(dá)了NoV Sydney株的受體結(jié)合區(qū)(P區(qū)域)并制備P顆粒，研究了Sydney株P(guān)顆粒與HBGAs之間的結(jié)合模式，確定其感染的宿主范圍，為豐富我國GII.4型諾如病毒進(jìn)化規(guī)律及GII.4型諾如病毒的預(yù)防和控制提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1病毒株和唾液標(biāo)本GII.4型NoV SH 2012_05株來自上海市金山區(qū)疾病預(yù)防控制中心2012年的腹瀉樣本[11]，唾液標(biāo)本為本研究室保存，HBGAs表型已明確[12]。

1.2試劑Roche(羅氏)病毒RNA提取試劑盒，QIAGEN OneStep RT-PCR Kit、Takara高保真酶、感受態(tài)細(xì)胞Top10及BL21購自TIANGEN,CloneJET PCR Cloning Kit、小量質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖切膠回收試劑盒購自Thermo Scientific公司，限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI購自Fermentas公司，GST-Resin購自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，Thrombin酶購自GE公司，表達(dá)載體PGEX-4T-1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3病毒核酸提取采用PBS液(pH=7.4)將糞便樣本制備成10%的懸液,按照羅氏病毒RNA提取試劑盒的說明操作提取RNA樣本，-80 ℃保存。1.4SH 2012_05株P(guān)區(qū)域基因克隆根據(jù)GII.4/Sydney株ORF2序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增P區(qū)域的特異性引物Sydney F/R，如表1所示。以上述提取的病毒株SH 2012_05 RNA為模板，RT-PCR反應(yīng)參數(shù)：50 ℃逆轉(zhuǎn)30 min；95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃ 1 min；50 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增條帶大小約1 kb。將PCR產(chǎn)物連接到T-easy載體上，通過測序進(jìn)行鑒定，根據(jù)測序結(jié)果，利用Mega 6.0軟件，選取具有代表性的NoV GI和GII型參考株共16株構(gòu)建NoV P區(qū)域的進(jìn)化樹，采用Clustal W和Neighbor-joining法進(jìn)行比對和構(gòu)建。

表1GII.4型NoV Sydney株P(guān)區(qū)基因片段擴(kuò)增所用引物

Tab.1Primers used for the P region genes of GII.4 NoV Sydney

PrimerSequence(5'-3')SydneyFTCAAGAACTAAACCATTCTCSydneyRTTATAGTGCACGTCTACGCSydney(p)FGCACGGATCCTCAAGAACTAAACCAT-TCTCSydney(p)RGCATGCGGCCGCTTAGCAAAAG-CAATCGCCACGGCAATCGCATAGTG-CACGTCTACGC

1.5重組P顆粒表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計(jì)的擴(kuò)增P區(qū)的特異性引物，其上下游引物中分別引入BamHI和NotI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并在下游引物C末端加入CDCRGDCFC修飾氨基酸序列以促進(jìn)P顆粒的形成[13]，粗體標(biāo)記為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)BamHI和NotI，斜體標(biāo)記為CDCRGDCFC修飾氨基酸序列，見表1。以SH 2012_05株RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T-easy載體上。重組P區(qū)域克隆和表達(dá)載體PGEX-4T-1分別用BamHI和NotI雙酶切，將產(chǎn)物進(jìn)行回收純化后連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)菌。通過酶切和測序確定重組質(zhì)粒中插入的序列。

1.6SH 2012_05株P(guān)顆粒制備經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)，通過SDS-PAGE電泳鑒定重組融合蛋白。利用GST蛋白瓊脂糖4B親和純化柱對重組融合蛋白純化，純化后利用凝血酶除去融合蛋白的標(biāo)簽部分。將純化的目的蛋白洗脫下來后用于Western blot鑒定和結(jié)合HBGAs受體的特性研究。

1.7P顆粒的Western blot鑒定分析取10 μL樣品于SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，膜依次用5 %脫脂奶封閉、鼠抗NoV多抗血清(1∶1 000)、羊抗鼠辣根過氧化物IgG(1∶3 000)孵育、PBST充分洗滌，最后HRP-DAB底物顯色。

1.8ELISA法檢測P顆粒與HBGAs受體的結(jié)合特性將唾液標(biāo)本用PBS(pH=7.4)按1∶1 000稀釋，包被于96孔酶聯(lián)板(100 μL/孔)過夜，5 %脫脂奶封閉1 h，將SH 2012_05株和GII.4/2004株 (本實(shí)驗(yàn)室保存)P顆粒用PBS稀釋成20 μg/mL，37 ℃孵育1 h，每孔加入鼠抗NoV多抗血清(1∶1 000)100 μL，37 ℃孵育1 h，再加入羊抗鼠辣根過氧化IgG(1∶3 000)37 ℃孵育1 h，加入TMB避光顯色10 min，最后加入2 mol H3PO4終止顯色，酶標(biāo)儀450 nm波長處測定OD值。

2結(jié)果

2.1P區(qū)域基因擴(kuò)增及氨基酸序列進(jìn)化樹構(gòu)建獲得NoV P區(qū)域基因片段，大小為1 kb，片段連接至T-easy載體。進(jìn)化樹結(jié)果顯示：SH 2012_05株和SH 2012_06株與GII.4型NoV參考株在同源性上達(dá)到88%～99.1%，與Sydeny/2012原型株同源性達(dá)到99.9%，且劃分為同一分支，系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1，結(jié)合氨基酸序列分析2012年上海市金山區(qū)NoV暴發(fā)現(xiàn)場分離的病毒株屬于NoV新型變異株 GII.4/Sydeny/2012。

圖1　NoV P區(qū)域氨基酸序列進(jìn)化樹構(gòu)建Fig.1　Phylogenic tree of amino acid sequences of NoV P domain

2.2重組P顆粒表達(dá)載體的建立選用SH 2012_05株用于P顆粒的表達(dá)。重組質(zhì)粒酶切電泳鑒定，1 %瓊脂糖電泳酶切后的P區(qū)域片段和線性PGEX-4T-1載體，大小分別為1 kb和4.9 kb，證明已將SH 2012_05株 P區(qū)域成功導(dǎo)入表達(dá)載體PGEX-4T-1，完成了重組表達(dá)載體的構(gòu)建。

注：M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～4：P顆粒；5：GST-P融合蛋白M: Protein marker; 1-4: P particle; 5: GST-P fusion protein.圖2　GST融合P顆粒大腸桿菌表達(dá)及P顆粒的純化Fig.2　Production of P-GST fusion protein and purification of the P particle

2.3SH 2012_05株P(guān)顆粒的誘導(dǎo)表達(dá)根據(jù)SDS-PAGE電泳如圖2所示，重組融合蛋白大小為63 kD，經(jīng)凝血酶除去GST標(biāo)簽蛋白后，獲得約為36 kD的目的蛋白，與預(yù)期P顆粒大小一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)P顆粒的特異性，將SDS-PAGE凝膠分離的目的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，經(jīng)特異性抗體進(jìn)行Western blot分析，在大小為36 kD位置顯示條帶見圖3,證明了研究所用的原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)表達(dá)的重組P顆粒具有特異性。2.4GII.4型 NoV Sydney株唾液結(jié)合模式SH 2012_05 Sydney株與唾液HBGAs的結(jié)合模式，如圖4所示SH 2012_05株基因簇毒株與A、B、O、AB型分泌型唾液均能結(jié)合，其中結(jié)合B型抗原親和力最高[4]；與非分泌型唾液不結(jié)合。

注：M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：GST-P融合蛋白；2：P顆粒蛋白M: Protein marker; 1: GST-P fusion protein; 2: P particle.圖3　重組SH 2012_05株P(guān)顆粒的Western blot印跡分析Fig.3　Western blot analysis of re-combinant P particle of SH 2012_05 strain

圖4　Sydney株P(guān)顆粒與唾液HBGAs受體結(jié)合能力Fig.4　Binding activity of Sydney strain with HBGAs receptor

3討論

NoV結(jié)構(gòu)蛋白VP1是主要的抗原決定簇，研究表明在NoV P區(qū)域C末端加入CDCRGDCFC修飾氨基酸序列可以促進(jìn)P顆粒的形成。由于人類NoV至今尚不能在細(xì)胞中有效的培養(yǎng)，也沒有合適的感染動物模型，作為候選亞單位疫苗的P顆粒[10]已同時成為研究NoV與受體結(jié)合模式研究的重要手段。

自20世紀(jì)90年代確認(rèn)GII.4 型NoV導(dǎo)致絕大部分NoV胃腸炎暴發(fā)以來，GII.4一直為全球優(yōu)勢流行株。其傳染性強(qiáng)極易引起暴發(fā)流行，帶來了沉重的疾病負(fù)擔(dān)。2012年底，新出現(xiàn)的GII.4/2012基因簇(代表株Sydney株)，亦蔓延至歐美、亞洲造成新一輪的世界大流行，已至少造成幾百萬人感染。GII.4型NoV的疫苗研究是預(yù)防和控制NoV的重要手段，其疫苗株的選擇和儲備是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本研究成功的表達(dá)了Sydney株的P顆粒，為疫苗株的選擇及亞單位疫苗研制開發(fā)提供了技術(shù)儲備。

GII.4型NoV每隔2～3年形成新的基因簇，并導(dǎo)致新一輪的全球流行。其進(jìn)化的分子機(jī)制對于理解NoV的流行病學(xué)，尤其是制定疫苗研制策略至關(guān)重要。目前，GII.4型NoV的分子進(jìn)化機(jī)制尚不明確，初步認(rèn)為宿主受體識別、宿主免疫、序列空間及復(fù)制動力學(xué)這4個因素可能是影響其進(jìn)化方向和速度的重要因素；其中宿主受體的識別機(jī)制及宿主免疫壓力被認(rèn)為是最主要因素[14-15]。

HBGAs是一類具有高度多態(tài)性的糖類抗原，廣泛分布于紅細(xì)胞、呼吸道，泌尿生殖和消化道粘膜上皮細(xì)胞表面。北美和歐洲人群中，分泌型人群約占80%，而中國人群中，分泌型的人群占80%～90%。近30年來，GII.4型一直是全球流行的主要病毒株，我們前期研究表達(dá)了除Sydney以外GII.4不同基因簇的P顆粒，結(jié)果表明1987-2012年近20年間不同基因簇P顆粒結(jié)合HBGAs的親和力存在差異，但結(jié)合模式相似，即與A、B、O型分泌型結(jié)合，與非分泌型不結(jié)合[4,16]。本研究表達(dá)了我國的Sydney株P(guān)顆粒，與前期結(jié)果一致。Sydney株保持了GII.4能識別所有分泌型HBGA受體的能力，進(jìn)一步表明了Sydeny株能廣譜的易感宿主是成為新的世界流行株的重要原因之一。

本研究成功表達(dá)了我國新現(xiàn)GII.4 NoV優(yōu)勢流行株Sydney株，為我國進(jìn)一步研制開發(fā)NoV疫苗提供了技術(shù)儲備；研究進(jìn)一步豐富了我國GII.4型NoV進(jìn)化規(guī)律，這將為GII.4型諾如病毒的預(yù)防和控制提供科學(xué)基礎(chǔ)。

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DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.006

通訊作者：胡貴方，Email:guif-hu@sina.com；

中圖分類號：R373.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)04-0344-05

收稿日期：2015-10-09修回日期：2016-01-23

Expression of NoV GII-4 Sydney strain P particle and analysis of its binding activity with HBGAs receptor in China

ZHANG Ting1, LONG Yan2, ZHANG Xu-fu2, HU Gui-fang1,DAI Ying-chun1

(1.DepartmentofEpidemiology,SchoolofPublicHealthandTropicalMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2.SchoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:There was a newly emerging predominant GII.4 norovirus, Sydney variants, in China. To explore its binding patterns with HBGAs receptor, we cloned the P domain genes of norovirus SH 2012_05 and constructed recombinant plasmid. After that we expressed P particle by prokaryotic system and determined its binding profile by using ELISA saliva method. Like former studies, results showed that SH 2012_05 P particle could bind to saliva of all kind of secretors, including A-group, B-group, AB-group, O-group, in which it showed stronger binding affinity to B-group. In the present study, technical reserve of P particle was stored as a choice for vaccine candidate, which provides a scientific basis to prevent and control GII.4 norovirus.

Keywords:norovirus; GII.4 genotype; Sydney strain; P particle; human histo-blood group antigen

國家自然科學(xué)基金 (No.81473402)；廣東省自然科學(xué)基金(No.2014A030313332)和南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院第十期院長基金(No.GW201503)聯(lián)合資助

戴迎春，Email: yingchun78@hotmail.com