涂海健　陳淑娟　林群英　許光輝

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耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測及分析

涂海健1★陳淑娟1林群英2許光輝1

［摘要］目的分析耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）耐藥情況與耐藥相關(guān)基因的關(guān)系，了解其耐藥機(jī)制。方法采用PCR技術(shù)檢測29株碳青霉烯類耐藥KPN與產(chǎn)碳青霉烯酶、超廣譜b?內(nèi)酰胺酶（extended?spectrumb?lactamases，b?ESBLs）、ampC酶及喹諾酮類耐藥相關(guān)基因blaKPC?2、blaIMP?4、blaCTX?M、blaCTX?M?15、blaVIM?1、blaTEM、blaSHV、ampC、gyrA、parC，并對(duì)KPC?2、ampC、gyrA基因進(jìn)行序列分析。結(jié)果用PCR技術(shù)證實(shí)了29株為產(chǎn)KPC、IMP型碳青霉烯酶的KPN，并且攜帶TEM、SHV型b?ESBLs，其中18株同時(shí)編碼ampC基因；29株待測菌均檢出喹諾酮類耐藥相關(guān)gyrA、parC基因。KPC基因片段同源性分析顯示，待測菌株之間核苷酸同源性為98%~100%，氨基酸同源性為97%~100%；與肺炎克雷伯氏菌Kpn?1504株之間的核苷酸同源性最高，為99%~100%。gyrA、parC基因突變率分別為58.6%、62.1%。結(jié)論產(chǎn)KPC?2、IMP?4型碳青霉烯酶同時(shí)攜帶多種b?ESBLs、ampC基因及突變的喹諾酮類耐藥相關(guān)gyrA、parC基因的KPN耐藥情況更加嚴(yán)重，同時(shí)存在克隆性流行可能。

［關(guān)鍵詞］肺炎克雷伯菌；blaKPC；超廣譜b?內(nèi)酰胺酶；基因；PCR

隨著耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）出現(xiàn)和臨床檢出不斷增多，給臨床抗感染治療和醫(yī)院內(nèi)感染控制帶來極大的困難，嚴(yán)重威脅人們的健康［1］。本研究對(duì)莆田學(xué)院附屬醫(yī)院檢出29株耐碳青霉烯類抗生素KPN進(jìn)行耐藥基因檢測和分析，旨在本院耐碳青霉烯類抗生素KPN的耐藥機(jī)制和，為控制和預(yù)防耐碳青霉烯類抗生素藥菌KPN提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1菌種來源

收集2013年6月至2014年6月學(xué)院附屬醫(yī)院臨床科室送檢標(biāo)本。質(zhì)控菌株部臨床檢驗(yàn)中心提供肺炎克雷伯菌ATCC?73、大腸埃希氏菌ATCC?25922、銅綠假單脆菌ATCC?27853。

1.2主要試劑和儀器

法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK?2 Com?pact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定、藥敏分析系統(tǒng)及配套GN鑒定卡、AST?13藥敏卡；英國OXOID公司生產(chǎn)的藥敏紙片；德國QIAGEN公司生產(chǎn)飛Taq PCR Mas?ter Mix Kit；美國Life Technologies公司生產(chǎn)的VeritiTM 96孔梯度PCR儀。

1.3藥敏試驗(yàn)

采用VITEK?2 Compact藥敏分析系統(tǒng)及K?B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果嚴(yán)格按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Stan?dards Institute，CLSI）（2010M100?S20）的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4碳青霉烯酶篩選

1.4.1改良Hodge法

將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌ATCC25922均勻涂布在MH平板上，中間貼亞胺培南的紙片（10 μg/片），將實(shí)驗(yàn)菌株以亞胺培南紙片為起點(diǎn)，沿離心方向劃線，35℃培養(yǎng)過夜，抑菌圈內(nèi)呈出現(xiàn)矢狀者為陽性，并設(shè)陰陽性對(duì)照。

1.4.2EDTA協(xié)同試驗(yàn)

取0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇郎y菌均勻涂布在MH平板上，貼美羅培南紙片（10 μg/片），在距離1 cm地方貼一空白紙片，在其上面滴加0.5 mmol/L的EDTA 4 μL，35℃培養(yǎng)過夜，觀察美羅培南抑菌圈在在靠近EDTA紙片側(cè)明顯擴(kuò)大即為產(chǎn)金屬酶菌。

1.5耐藥基因DNA提取

挑取3~6個(gè)新鮮菌落，采用核酸提取試劑盒（硅膠膜?離心柱法）（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），嚴(yán)格按說明書操作進(jìn)行耐藥相關(guān)基因DNA提取。

1.6耐藥基因PCR檢測

PCR引物設(shè)計(jì)合成：GenBank上查找目的基因DNA序列，采用Primer express 2.0軟件在編碼序列（coding sequence，CDS）區(qū)進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，引物合成由中山達(dá)安基因公司通過ABI 3900臺(tái)式高通量DNA合成儀合成，具體見表1。

PCR反應(yīng)體系配制：按QIAGEN Taq PCR Master Mix Kit試劑盒說明書要求進(jìn)行，Taq PCR Master Mix 50 μL，F(xiàn)上游引物1 μL，R下游引物1 μL，模板核酸10 μL，ddH2O 38 μL，共100 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；變性94℃30 s，退火55℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物在新鮮配制2%瓊脂糖凝膠，以Thermo?100bp?Marker為對(duì)照進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖1。

1.7序列測定與分析

1.7.1測序PCR體系配制

PCR產(chǎn)物10 ng，測序buffer 3 mL，BigDye 2 mL，測序引物（表1）1 mL，去離子水補(bǔ)到20 mL。按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：預(yù)變性96℃5 min；變性94℃30 s，退火60℃45 s，72℃45 s，40個(gè)循環(huán)；延伸72℃10 min；4℃保存。

1.7.2測序產(chǎn)物純化

每管分別加入2 mL 125 mmol EDTA和2 mL 3 mol NaAc到管底；再加入50 mL 100%酒精，震蕩混勻，避光室溫放置15 min；12 000 rpm離心30 min，去上清；每管加入150 mL 70%冷酒精，12 000 rpm離心15 min，去上清（重復(fù)1次）。室溫陰干酒精，加入10 mL Hi?Di Formamide振蕩溶解DNA。溶解后的樣品在95℃變性5 min，迅速置冰中冷卻至少2 min后上儀器測序。

1.7.3基因分析儀測序

純化后的測序產(chǎn)物加入與基因分析儀配套的96孔板，蓋好，記錄加樣順序。用ABI公司Data Collection?軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集得到ab1、hd1及seq格式的文件。KPC?2序列采用cluster W軟件進(jìn)行同源性分析。gyrA、parC序列用chromas軟件作BLAST Search比對(duì)。

表1　靶基因引物和目的產(chǎn)物長度Table 1　Primer sequencing of targeted genes and length of target products

2　結(jié)果

2.1耐碳青霉烯類抗生素KPN耐藥情況

對(duì)碳青霉烯類抗生素亞胺培南、厄他培南耐藥的29株菌株進(jìn)行耐藥基因研究，具體結(jié)果見表2。

2.2碳青霉烯酶篩選結(jié)果

29株標(biāo)本改良Hodge法和EDTA協(xié)同試驗(yàn)均為陽性，提示待測菌株產(chǎn)碳青霉烯酶和金屬酶。

2.3耐藥基因PCR檢測結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1，相應(yīng)產(chǎn)物長度（bp）見表1，瓊脂糖凝膠電泳圖中1、8、10號(hào)結(jié)果陰性對(duì)應(yīng)的基因?yàn)镃TX?M?15、CTX?M、VIM?1；2號(hào)結(jié)果顯示2條電泳條帶分子量約520 bp對(duì)應(yīng)的是ampC基因，分子量約200~300 bp條帶可能污染導(dǎo)致，其他擴(kuò)增產(chǎn)物都在相應(yīng)位置顯示陽性結(jié)果。

2.3.1產(chǎn)超廣譜b?內(nèi)酰胺酶基因

29株耐碳青霉烯類抗生素KPN都檢出bla?TEM、blaKPC、blaSHV、blaIMP耐藥基因，CTX?M、CTX?M?15、VIM?1未檢出。

2.3.2產(chǎn)ampC酶基因檢出情況

共檢出18株耐碳青霉烯類抗生素KPN ampC耐藥基因，檢出率為62.1%（18/29）。

表2　耐碳青霉烯類抗生素KPN耐藥情況Table 2　The resistance of carbapenem?resistant KPN

2.3.3耐喹諾酮類藥相關(guān)基因

29株待測菌均檢出gyrA、parC基因。

2.4耐藥基因序列分析

2.4.1KPC?2基因片段同源性分析

同源性比較結(jié)果顯示：待測菌株之間核苷酸同源性為98%~100%，氨基酸同源性為97%~100%；與肺炎克雷伯氏菌Kpn?1504株之間的核苷酸同源性最高，為99%~100%，與肺炎克雷伯氏菌Kpn?1504株氨基酸同源性最高，為96%~99%。

2.4.2KPC?2基因序列進(jìn)化樹分析

將待測菌株與GenBank中發(fā)布的菌株序列構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2）。

2.5gyrA、parC基因突變分析

對(duì)gyrA、parC基因序列（圖3和圖4）分析發(fā)現(xiàn)gyrA基因突變率為58.6%（17/29）、parC基因突變率為62.1%（18/29）。基因突變主要集中在gyrA編碼基因第83、87位密碼子和parC編碼基因80位密碼子上。

3　討論

自2001年美國首次報(bào)道產(chǎn)碳青霉烯酶的KPN［2］，隨著碳青霉烯類藥物在臨床上廣泛使用，碳青霉烯類耐藥KPN檢出不斷增多［3?4］，有關(guān)碳青霉烯酶的耐藥機(jī)制的研究已成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)［5?6］。本研究29株耐碳青霉烯類抗生素KPN對(duì)亞胺培南耐藥，對(duì)其他抗菌藥物包括加酶抑制劑在內(nèi)臨床常用的幾乎所有β?內(nèi)酰胺類藥物耐藥（舒普深耐藥96.6%除外），對(duì)所有氟喹諾酮類和氨基糖苷類藥物耐藥，僅對(duì)米諾環(huán)素和多粘菌素B敏感，表現(xiàn)為多重耐藥或泛耐藥菌，KPN此表現(xiàn)對(duì)多種抗生素的耐藥率均高達(dá)100%，較為罕見，可能與研究對(duì)象選擇導(dǎo)致的差異性有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

對(duì)29株耐碳青霉烯類抗生素KPN相關(guān)耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)其同時(shí)存在分別編碼非金屬、金屬型碳青霉烯酶的KPC?2和blaIMP基因，寧長秀［7］和Wei等［8］也有報(bào)道檢測出同時(shí)產(chǎn)KPC?2和IMP?4酶的KPN株，認(rèn)為其會(huì)導(dǎo)致KPN耐藥更強(qiáng)，也證明了產(chǎn)碳青霉烯酶是KPN耐碳青霉烯類抗菌藥物主要原因。

29株耐碳青霉烯類抗生素KPN菌還檢測出攜帶編碼產(chǎn)β?內(nèi)酰胺酶的blaTEM、blaSHV基因，其中18株同時(shí)檢測出ampC酶基因，說明耐碳青霉烯類抗生素KPN存在多種耐藥基因積聚共存現(xiàn)象，高麗華等［9］從耐碳青霉烯類抗生素KPN菌中檢測出3株同時(shí)編碼ESBL和ampC基因，其中2株攜帶3種β?內(nèi)酰胺酶基因，Ogbolu［10］和趙曉杰等［11］也認(rèn)為產(chǎn)β?內(nèi)內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌往往同時(shí)攜帶其他種類抗菌藥物的耐藥基因。這種產(chǎn)生碳青霉烯酶和多種β?內(nèi)酰胺酶出現(xiàn)在單一細(xì)菌中，給臨床抗感染治療帶來到很大困難。

所研究29株菌都表現(xiàn)氟喹諾酮類抗生素耐藥，目前認(rèn)為氟喹諾酮類耐藥決定區(qū)（quinnlone re?sistance determing region，QRDR）編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶gyrA基因及編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶parC基因突變與氟喹諾酮類耐藥相關(guān)［12］。29株碳青霉烯類耐藥的KPN均檢測出gyrA、parC基因，但gyrA、parC基因突變率分別為58.6%、62.1%，無法解釋所有研究菌株都表現(xiàn)氟喹諾酮類抗生素耐藥，說明氟喹諾酮類耐藥還有其他機(jī)制導(dǎo)致。

對(duì)所檢測菌株的KPC?2基因與Genbank進(jìn)行BLAST比較發(fā)現(xiàn)銅綠假單菌（NG036544.1）、大腸埃希菌（KR052097.1）、粘質(zhì)沙雷氏菌（CP011639.1）、陰溝腸桿菌（CP008901.1）、弗氏檸檬酸桿菌（KP987215.1）等菌的質(zhì)粒均檢出相同的基因其同源性達(dá)99%，說明質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)碳青霉烯酶基因可在不同菌種中傳播，Qi等［13］認(rèn)為編碼KPC?2和IMP?4酶的基因位于可移動(dòng)質(zhì)粒上，可通過耐藥基因水平和克隆播散，在不同菌種之間轉(zhuǎn)移，造成醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行；對(duì)待測菌株之間同源性分析，結(jié)果顯示核苷酸同源性為98%~100%，氨基酸同源性為97%~100%；與肺炎克雷伯氏菌Kpn?1504株之間的核苷酸同源性最高，為99%~100%，提示存在克隆性流行可能。

綜上耐碳青霉烯類抗生素KPN是多種耐藥機(jī)制導(dǎo)致，不僅產(chǎn)blaKPC?2、blaIMP?4型碳青霉烯酶同時(shí)攜帶b?ESBLs、ampC基因及突變的喹諾酮類耐藥相關(guān)gyrA、parC基因，從而使其耐藥情況更加嚴(yán)重；29株研究菌blaKP?2C基因同源性高提示醫(yī)院存在質(zhì)粒介導(dǎo)克隆性耐藥基因流行可能。

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2.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，福建，莆田351100★通訊作者：涂海健，E?mail：tufangshu@126.com

基金項(xiàng)目：福建省莆田市科技計(jì)劃［2013S03（4）］

作者單位：1.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建，莆田351100

Detection and analysis of the drug resistant genes associated with carbapenem?resistantKlebsiella pneumoniae

TU Haijian1★，CHEN Shujuan1，LIN Qunying2，XU Guanghui1
（1.Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Putian College，Putian，F(xiàn)ujian，China，351100；2.Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Putian College，Putian，F(xiàn)ujian，China，351100）

［ABSTRACT］ObjectiveTo analyze the relationship between the resistance of carbapenem?resistant Klebsiella pneumoniae(KPN)and the related gene of drug resistance,and to understand the mechanism of drug resistance.MethodsThe genes of blaKPC?2,blaIMP?4,blaCTX?M,blaCTX?M?15,blaVIM?1,blaTEM, blaSHV,ampC,gyrA and parC of quinolone?resistance were detected by polymerase chain reaction(PCR), which related producing carbapenemase,extended?spectrumb?lactamases(b?ESBLs),ampC enzyme in 29 strains of carbapenem?resistant pneumonia Klebsiella.And Kpc?2,parC and gyrA were performed by DNA sequencing.Results29 strains of KPN producing KPC and IMP type of carbapenemase were identified by PCR at the same time.They also carried blaTEM and blaSHV genes of beta?ESBLs,among which 18 strains encoded AmpC gene.In addition,gyrA and parC gene were detected in all strains.KPC gene fragment homologous analysis showed that the tested strains between nucleotide homology was 98%to 100%,while the homology of amino acid is 97%~100%.They showed the highest nucleotide homology of 99%~100%withReber ? s bacteria Kpn?1504 strains.The gene mutation rate of gyrA and Parc were 58.6%and 62.1%, respectively.ConclusionThe resistant situation of KPC?2,IMP?4 type carbapenemase producing KPN which were carrying a variety ofb?ESBLs,AmpC genes and mutation of resistance to quinolones gyrA and Parc genes is more serious,while there may exist the clonal epidemic.

［KEY WORDS］Klebsiella pneumoniae;blaKPC;Extended?spectrumb?lactamases;Gene;PCR