李良，金文娟（武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430070）

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枸杞多糖含量測定方法的比較分析

李良，金文娟
（武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430070）

摘要：利用紫外分光光度計，采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品，對比苯酚-硫酸法（方法Ⅰ）、《中國藥典》中方法（方法Ⅱ）及改進后的苯酚-硫酸法（方法Ⅲ），在485nm處測定枸杞多糖的含量，比較3種方法的優(yōu)劣。試驗表明：3種方法標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.930 9、0.991 8、0.996 8；吸光值穩(wěn)定性RSD值分別為10.95%、2.13%、0.13%；回收率試驗中方法Ⅲ的相對誤差較小，無顯著差異。可見方法Ⅲ最優(yōu)。

關(guān)鍵詞：枸杞多糖；分光光度計法；比較分析

枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide）是從枸杞子中提取的一種水溶性多糖，具有降血脂、降血糖、保肝、抗腫瘤、抗衰老等多種生理功能［1-2］，其含量常作為評價某些中藥材及中藥制劑質(zhì)量的重要指標［3］；羅瓊等［4］以純枸杞多糖研究表明其顯示出比粗枸杞多糖有更明顯的免疫增強效應(yīng)；王柏昆等［5］實驗證明10 mg/kg枸杞多糖對荷瘤小鼠抑瘤率達31%；衣艷君［6］發(fā)現(xiàn)，枸杞子多糖能有效降低高脂血癥大鼠血清中TC含量，具有明顯的降血脂功能，調(diào)節(jié)脂類代謝的功能；陳立群等［7］研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的枸杞多糖能夠使鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠受損胰島β細胞得到恢復(fù)，胰島素分泌增加，血糖濃度降低，對STZ所致糖尿病大鼠具有較好的治療作用。邊綸等［8］實驗結(jié)果表明，枸杞多糖對四氯化碳引起的肝損傷有修復(fù)作用，并促進肝細胞再生。

枸杞多糖由于具有重要的生物學功能，因此，多糖的檢測方法也備受關(guān)注。付艷麗等［9］針對枸杞多糖含量進行研究，于室溫下反應(yīng)15 min后，靜置于室溫，在490 nm波長處測定枸杞多糖含量；《中國藥典》中枸杞多糖含量的測定方法是：于40℃水浴中保溫15 min后，靜置至室溫后，在490 nm波長進行檢測；任一平［10］對香菇多糖產(chǎn)品簡易預(yù)處理，選用硫酸鈉溶液作為流動相，在示差折光檢測器下檢測，選擇右旋糖酐為標準物質(zhì)，用外標法完成了香菇多糖的含量測定。

本文中枸杞多糖的測定方法采用苯酚-硫酸法。利用紫外分光光度法測定其含量，《中國藥典》及相關(guān)文獻［11］均有此方法的記載，但經(jīng)過多次試驗，其吸光值極不穩(wěn)定，給標準曲線的制作和后期定量測定帶來困難。本試驗按照《中國藥典》和相關(guān)文獻［11］中枸杞多糖的檢測方法，對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及反應(yīng)終止方法進行優(yōu)化，以標準曲線相關(guān)系數(shù)，吸光值的穩(wěn)定性及回收率的比較，得到最佳的試驗方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

枸杞多糖提取物：枸杞多糖含量30%、50%，西安和霖生物有限公司；葡萄糖標準品：HPLC≥98%，中國生物制品檢定所；苯酚、濃硫酸：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

UV-2700紫外可見分光光度計：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；ME3002E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1試驗原理

本試驗采用苯酚-硫酸法測枸杞多糖的含量。苯酚-硫酸法由Dubois等［12］建立，其原理是利用濃硫酸將多糖水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，再和苯酚縮合成有色化合物，用紫外分光光度法測定其含量。此法靈敏度高、顯色較穩(wěn)定，是枸杞多糖最常用的檢測方法。但由于對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及反應(yīng)終止方法缺乏統(tǒng)一標準，《中國藥典》及各文獻記載［13-14］的處理方法也不盡相同，本試驗研究了不同的處理方式對多糖含量測定結(jié)果的影響，其中方法Ⅰ參照文獻［11］，方法Ⅱ根據(jù)《中國藥典》中的方法［3］，方法Ⅲ是改進的方法。

苯酚-硫酸法（方法Ⅰ）：添加完濃硫酸后，室溫反應(yīng)15 min后，靜置至室溫后，紫外可見光分光光度計下進行檢測。

《中國藥典》測定方法（方法Ⅱ）：參照《中國藥典》中枸杞多糖含量的測定方法，添加完濃硫酸后，置40℃水浴中保溫15min，取出，靜置至室溫后進行檢測。

改進苯酚-硫酸法（方法Ⅲ）：添加完濃硫酸后，沸水浴中反應(yīng)15 min，取出立即進行冰水浴（水溫0℃左右），冷卻至室溫后進行檢測。

1.2.2枸杞多糖溶液的配制

稱取40 mg枸杞多糖50%的提取物于50 mL燒杯中，加水溶解，定容至100 mL，搖勻備用。

1.2.3溶液的配制

1.2.3.15%苯酚溶液的配置

60℃水浴使苯酚溶解，加少量蒸餾水隔絕空氣，精密吸取苯酚溶液5 mL至100 mL棕色容量瓶中，加水定容至刻度。

1.2.3.2對照品溶液的制備

精密稱取105℃烘至恒重的葡萄糖對照品50 mg 至100 mL小燒杯中，加適量水溶解，移至500 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含無水葡萄糖0.1 mg）。

1.2.4最佳吸收波長掃描

以10 μg/mL的標準品為樣品，用方法Ⅱ中處理方法，在波長為400 nm～800 nm間做全波長掃描，與文獻報道［11］的枸杞多糖測定的最大吸收波長490 nm左右作對比，確認其最大吸收波長。

分別吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL葡萄糖對照品溶液，注為0#、1#、2#、3#、4#、5#，補水至2.0 mL，加5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速垂直加入5.0 mL濃硫酸，振蕩5 min后，按照3種不同的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及不同的反應(yīng)終止方法進行處理，在最大吸收波長下，用紫外分光光度法測其吸光值，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.6吸光值穩(wěn)定性的比較

為了檢驗3種不同的處理方法對吸光值的穩(wěn)定性。分別以3種方法中5#（10 μg/mL的標準品）為試驗樣品，每隔30 s測定一次吸光值，共測定10次，計算其RSD值，比較3種方法吸光值的穩(wěn)定性。

1.2.7回收率測定

用方法Ⅲ中的標準曲線分別對已知含量為30%、50%的枸杞多糖及葡萄糖標準品（HPLC≥98%）進行測定。每組樣品平行檢測6次，計算其平均值與相對誤差。

2　結(jié)果與討論

2.1最佳吸收波長確定

根據(jù)文獻資料［11］及枸杞多糖檢測試驗原理可知，反應(yīng)形成的顯色化合物在490 nm左右的波長下有最大吸收值，通過對400 nm～800 nm做全峰值掃描級峰值檢測，掃描圖譜如圖1所示。

一個月后，出差回來的郭啟明打開電腦上網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)有人在QQ上給自己留言：“沒有想到風度翩翩的郭總還稀罕老婆？如果你樂意的話，我就湊合湊合吧！”這樣的直白和挑釁，讓郭啟明頓時產(chǎn)生了莫名其妙的好感。她到底是誰呢？哪有女孩子這么主動的？他不禁想與這個女孩說說話。

圖1　葡萄糖標準品反應(yīng)最佳吸收波長掃描圖Fig.1　Optimum absorption wavelength scan of glucose standard reaction

由圖1可知，標準品在485 nm下有最大吸收波長，同時對比文獻資料［11］所述最大吸收波長在490 nm左右，可知，最大吸收波長為485 nm。

2.2多糖測定標準曲線的繪制

標準品在同種濃度下，用3種不同的方法處理后，所檢測的吸光值見表1。

表1　3種方法濃度及吸光值Table 1　Concentration and absorbance value of three methods

由表1可以看出，標準品在同種濃度下，3種方法所得的吸光值不同。其中方法Ⅲ所得標準曲線方程為y=0.049 3x+0.014 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 8，標準曲線見圖2，相關(guān)系數(shù)最高，回歸性最好。

2.3三種方法吸光值穩(wěn)定性的比較

以10 μg/mL的標準品為樣品，用3種方法分別在不同時間測定其吸光值，每隔30 s測定一次，共測定10次，比較3種方法吸光值的穩(wěn)定性，計算其RSD值，見表2。

圖2　采用方法Ⅲ得到的標準曲線Fig.2　The standard curve using by methodⅢ

表2　3種方法吸光值穩(wěn)定性的比較Table 2　Light absorption value stability comparison of the three methods

以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測多糖含量時最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是反應(yīng)后的顯色。有報道認為，影響顯色的重要因素是水浴溫度和水浴放置時間［15-16］。

通過3種顯色處理方法結(jié)果可知，根據(jù)《藥物分析》中要求，重復(fù)性儀器精密度中紫外RSD值≤5%，方法精密度RSD值≤3%，根據(jù)RSD值比較可知：

方法Ⅰ于室溫下靜置，反應(yīng)進行不完全，吸光值穩(wěn)定性較差，因而對標準曲線的繪制也有較大影響，曲線相關(guān)系數(shù)也較差。

方法Ⅱ雖然是《中國藥典》中引用的標準方法，但是筆者在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，由于反應(yīng)后快速檢測，并沒有進行冰水浴，所以并沒有對反應(yīng)進行終止，也會影響試驗結(jié)果。

而筆者改進過的方法Ⅲ采用沸水浴加熱，因其能促使縮合反應(yīng)更為完全，反應(yīng)后立即進行冰水浴及時終止反應(yīng)，由于其吸光值趨于穩(wěn)定，變化幅度較小，曲線相關(guān)系數(shù)也較好。

三種方法吸光值趨勢圖見圖3。

圖3　三種方法吸光值趨勢圖Fig.3　Light absorption value trend graph of the three methods

根據(jù)圖3三種方法吸光值趨勢圖也可看出，方法Ⅲ的吸光值最為平穩(wěn)，變化幅度小，穩(wěn)定性較好。

2.4回收率測定

回收率的測定見表3。

表3　回收率的測定Table 3　Test of recovery

用方法Ⅲ中的標準曲線分別對已知含量為30%、50%的枸杞多糖及葡萄糖標準品（HPLC≥98%）進行測定，檢驗其準確性，由6次平行試驗，得平均值為分別為30.03%、50.05%、98.21%，相對誤差分別為0.10%、0.04%、0.21%，說明由方法Ⅲ得到的標準曲線對多糖含量的測定具有較好的準確性。

3　結(jié)論

利用紫外分光光度計，采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品，對比方法Ⅰ、方法Ⅱ及方法Ⅲ，在485 nm處測定枸杞多糖的含量。結(jié)果表明：3種方法標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.930 9、0.991 8、0.996 8；吸光值穩(wěn)定性RSD值分別為10.95%、2.13%、0.13%；采用方法Ⅲ，以3種已知含量樣品做回收率試驗，3種樣品中方法Ⅲ的相對誤差分別為0.10%、0.04%和0.21%，無顯著差異。

試驗證明，方法Ⅲ最優(yōu)。即先沸水浴15 min，利用硫酸將枸杞多糖分解為單糖，迅速脫水生成糠醛衍生物，再和苯酚縮合成有色化合物，反應(yīng)趨于完全后，立即進行冰水浴，使反應(yīng)終止，放至室溫后測定其吸光值，可增加穩(wěn)定性，提高準確度，增強可操作性。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.033

基金項目：武漢市漢陽區(qū)科技創(chuàng)新項目

作者簡介：李良（1982—），男（漢），工程師，碩士研究生，主要從事飲料、酒類研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。

收稿日期：2015-05-11

Comparative Analysis Methods of Lycium barbarum Polysaccharide Content Determination

LI Liang，JIN Wen-juan

（Wuhan Pride Yellow Crane Tower Distillery Co.，Ltd.，Wuhan 430070，Hubei，China）

Abstract：Using the phenol-sulfuric acid method，with glucose as the standard by UV spectrophotometer and comparison of phenol-sulfuric acid method（methodⅠ），the method in China Pharmacopoeia（methodⅡ）and the method improved（methodⅢ），the content of Lycium barbarum polysaccharide was detected under 485 nm to compare the advantages of the three methods.Experiments showed that the three methods standard curve cor relation coefficient were 0.930 9，0.991 8，0.996 8，RSD of light absorption value stability were 10.95%，2.13%，0.13%；the relative error of recovery rate of methodⅢwas small，which showed no significant difference.It meant that the methodⅢwas the best.

Key words：Lycium barbarum polysaccharide；spectrophotometric method；comparative analysis