江學(xué)斌，陳嘉蔚，楊 軍，胡位榮，肖安吉，盧志鵬，楚品品，張玲華

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豬PR39真核表達(dá)載體構(gòu)建

江學(xué)斌1，陳嘉蔚2，楊 軍2，胡位榮1，肖安吉2，盧志鵬2，楚品品2，張玲華2

（1.廣州大學(xué)生物工程研究所，廣東 廣州510006；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510642）

摘 要：為構(gòu)建豬源抗菌肽PR39的高效表達(dá)真核載體pVAX1-PR39，通過(guò)豬股骨骨髓組織基因組RNA合成cDNA，根據(jù)PR39基因全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)高效表達(dá)啟動(dòng)子，利用PCR擴(kuò)增獲得PR39全長(zhǎng)基因，連接到真核載體pVAX1，構(gòu)建重組載體pVAX1-PR39。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站上豬源抗菌肽PR39基因序列完全一致，表明已成功構(gòu)建了豬PR39的真核表達(dá)載體，理論上所構(gòu)建的PR39表達(dá)載體能夠提高豬的免疫能力。

關(guān)鍵詞：抗菌肽；PR39；真核表達(dá)；載體；pVAX1

抗菌肽廣泛存在于自然界，是生物體內(nèi)存在的一種具有抗菌活性的小分子蛋白，氨基酸數(shù)目小于100，常帶正電荷，是生物體免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對(duì)抗外源性病原體致病作用的防御性多肽活性物質(zhì)［1］，是生物體先天免疫的重要組分，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌均有抑殺作用［2］。勒步尚等［3］發(fā)現(xiàn)抗菌肽或類似抗菌肽的小分子肽類廣泛存在于生物界，包括細(xì)菌、動(dòng)植物和人類。豬源抗菌肽是從豬體內(nèi)分離出來(lái)的一種抗菌肽。目前已經(jīng)從豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了12 種以上抗菌肽，這些抗菌肽具有不同的螺旋結(jié)構(gòu)，分子量相對(duì)較小，小于10 ku［4］?？咕腜R39是其中一類由39個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽，屬于Cathlin家族［5］，是眾多抗菌肽中的一種富含精氨酸的抗菌肽，由豬的小腸上皮細(xì)胞分泌［6］。作為一種肽類抗生素，抗菌肽PR39具有廣譜高效的抗菌作用，而且不易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥，因此在細(xì)菌感染的治療中PR39具有多方面優(yōu)勢(shì)，有望成為治療胞內(nèi)菌感染的新一代抗菌藥物。

已有研究表明，把抗菌肽作為飼料添加劑對(duì)豬的免疫能力有較大的提高［7］。因此，本研究針對(duì)仔豬構(gòu)建真核表達(dá)載體，根據(jù)PR39基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)高效表達(dá)核酸序列，將豬源PR39基因連接到載體pVAX1上。表達(dá)載體可以作為免疫佐劑與其他疫苗共同作用，從而達(dá)到增強(qiáng)仔豬免疫能力的目的。

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌DH5α，真核細(xì)胞表達(dá)載體pVAX1質(zhì)粒均由廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、NheⅠ、D2000 DNA marker購(gòu)自日本Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司；Goldview、高保真pfu酶購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，PCR擴(kuò)增試劑盒、凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、引物（表1）購(gòu)自上海生工生物公司；其他常用試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 cDNA合成 利用Trizol法提取豬股骨骨髓組織基因組RNA，選擇 OD260/OD280＞1.8且完整性好的RNA樣品為模板。根據(jù)從NCBI網(wǎng)站上查出的豬PR39基因序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Priemr 5.0設(shè)計(jì)2條引物PR39-F1、PR39-R2（表1）。RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×RTBuffer 2 μL、RT Enzyme Mix 0.5 μL、Primer Mix 0.5 μL、RNA 1 μg，ddH2O補(bǔ)足10 μL。PCR反應(yīng)程序：37℃15 min，98℃5 min。逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-80℃保存。

1.2.2 帶酶切位點(diǎn)PR39基因的擴(kuò)增 根據(jù)PR39基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異引物，考慮到翻譯起始需要依賴于mRNA 5′端帽子結(jié)構(gòu)，應(yīng)把PR39序列插至CPG序列前面。為了能使PR39基因在真核細(xì)胞中高效表達(dá)，本試驗(yàn)在真核載體pVAX1啟動(dòng)子前添加Kozak序列，在插入pVAX1的PR39基因全長(zhǎng)序列的引物PR39-F2和PR39-R2（表1）上分別加入Nhe I和 EcoR I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。

取上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）1μL、PR39-F2 （10 μmol/L） 1 μL、PR39-R2 （10μmol/L） 1 μL、PR39 1 μL、pfuDNA聚合酶（5 U/mL） 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 50 s、58℃ 30 s、72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)完畢后，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.2.3 pVAX1-PR39重組載體的構(gòu)建與鑒定 對(duì)載體pVAX1和PR39基因進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段后在16℃下T4連接酶作用16 h。取上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于含0.1 mg/mL Amp 的LB平板上37℃倒置培養(yǎng)16 h。挑取透明圓潤(rùn)、較大的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。配制菌落PCR體系：10×PCR Buffer 2 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.4 μL，dNTPs （10 mmol/L） 0.5 μL，引物T7 （10 μmol/L） 0.5 μL，PR39-R2 （10 μmol/L） 0.5 μL，Taq酶（5 U/μL） 0.5 μL，菌落裂解物5 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃50 s、58℃45 s、72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。將陽(yáng)性菌株委托上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，最終獲得含有目的片段的重組載體pVAX1-PR39。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬PR39基因克隆的檢測(cè)結(jié)果

采用引物PR39-F1和PR39-R1，以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，PCR擴(kuò)增所得豬抗菌肽PR39基因應(yīng)為535 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到與預(yù)期大小一致的目的條帶（圖1）。

M：DNA marker；1：PR39基因PCR產(chǎn)物圖1 豬PR39基因PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.2 帶酶切位點(diǎn)PR39基因的檢測(cè)結(jié)果

采用特異引物PR39-F2和PR39-R2，PCR擴(kuò)增得到帶有Nhe I 和EcoR I酶切位點(diǎn)的PR39全長(zhǎng)基因應(yīng)為539 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，與預(yù)期結(jié)果基本相符（圖2）。

M：DNA Marker；1：帶酶切位點(diǎn)PR39基因的PCR產(chǎn)物圖2 帶酶切位點(diǎn)PR39基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 pVAX1-PR39重組子的鑒定結(jié)果

挑取菌落進(jìn)行雙酶切，采用通用上游引物T7和下游引物PR39-R2進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果600 bp處有明顯條帶，與目的片段大小相符（圖3），因此可以初步判定pVAX1載體已成功連接上PR39。而將重組子委托上海生工序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站上豬的抗菌肽PR39的基因序列完全一致，因此判定pVAX1載體已成功連接上PR39。

M：DNA marker；1：pVAX1的PCR產(chǎn)物；2：pVAX1-PR39重組子PCR產(chǎn)物；3：pVAX1-PR39重組子雙酶切圖3 PCR及酶切鑒定重組質(zhì)粒pVAX1-PR39

3　結(jié)論與討論

近年來(lái)，養(yǎng)殖業(yè)藥物殘留和細(xì)菌耐藥性等問(wèn)題日漸嚴(yán)重，給人類的健康帶來(lái)潛在威脅［8］，引發(fā)了人們對(duì)食品安全的關(guān)注，因此尋找抗生素替代品已迫在眉睫?？咕木哂蟹肿恿啃?、熱穩(wěn)定、水溶性好、抗菌譜廣等特征，更重要的是，抗菌肽僅作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞［9］。目前，抗菌肽作為傳統(tǒng)抗生素的替代物因其自身特征而受到人們的關(guān)注，具有廣闊的應(yīng)用前景。抗菌肽除了可以直接殺滅入侵體內(nèi)的病原微生物外，還可以在宿主免疫反應(yīng)的不同階段表現(xiàn)出免疫增強(qiáng)作用［10］，其作用機(jī)制與抗生素通過(guò)阻斷大分子生物合成的作用機(jī)理完全不同，很難出現(xiàn)耐藥菌株［11］。

目前研究已發(fā)現(xiàn)PR39對(duì)常見(jiàn)病原微生物具有廣譜抗菌活性，也具有趨化、抑制炎癥、促進(jìn)損傷修復(fù)等免疫功能［12］。劉陽(yáng)欣等［13］將PR39全基因定向插入到表達(dá)載體 pCold質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)獲得有抗菌活性重組PR39抗菌肽。明飛平等［14］根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性，人工合成4條引物通過(guò)重疊獲得PR39基因，插入酵母表達(dá)載體pPIC9K，敲除部分多余核苷酸得到pPIC9K-PR39-D-E，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母SMD1168實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。劉濤等［15］構(gòu)建PR-39重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒，并在小鼠胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞 C3H10T1/2中高效表達(dá)。

本研究選擇以豬源抗菌肽PR39基因連接到載體pVAX1構(gòu)建重組載體，結(jié)果表明，豬PR39真核表達(dá)載體成功構(gòu)建，理論上所構(gòu)建的PR39表達(dá)載體能夠提高豬的免疫能力。但其實(shí)際功效、能否真正提高豬免疫能力還需要進(jìn)一步檢驗(yàn)。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

中圖分類號(hào)：S813.3；S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-874X（2016）03-

收稿日期：2015-10-12

基金項(xiàng)目：廣州市屬高?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（12014 20755）

作者簡(jiǎn)介：江學(xué)斌（1969-），男，博士，講師，E-mail：jxbcalvin@126.com

通訊作者：張玲華（1973-），女，博士，教授，E-mail：lhzhang@scau.edu.cn

Construction of eukaryotic expression vector of porcine PR39

JIANG Xue-bin1，CHEN Jia-wei2，YANG Jun2，HU Wei-rong1，XIAO An-ji2，LU Zhi-peng2，CHU Pin-pin2，ZHANG Ling-hua2
（1.Research Institute of Bioengineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China；2.College of Life Sciences，South China Agricultural University/ Key Laboratory of Agricultural Biological Protein Function and Regulation of Guangdong Province，Guangzhou 510642，China）

Abstract：To construct the eukaryotic expression vector of porcine antimicrobial peptide PR39，cDNA was synthesized by the RNA from bone marrow of porcine femur. According to the full length sequence of PR39 gene，a efficient expression gene sequence was designed，and the full length gene of PR39 was amplified by PCR and connected to the eukaryotic vector pVAX1，then the recombinant vector pVAX1-PR39 was constructed and transferred into E. coli DH5α followed by colony PCR identification and sequencing. The results showed that the sequences were completely consistent with the PR39 gene sequences published on NCBI. The PR39 eukaryotic expression vector was constructed and PR39 expression vector was capable of improving the immune ability of pig in theory.

Key words：antimicrobial peptide；PR39；eukaryotic expression；vector；pVAX1