王志鵬鄧 耿（清華大學(xué)化學(xué)系，北京00084；Department of Chemistry，TexasA&M University，Texas 77840，USA）

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基于輔因子化學(xué)本質(zhì)及功能的分類與討論

王志鵬1，2鄧 耿1，*
（1清華大學(xué)化學(xué)系，北京100084；2Department of Chemistry，TexasA&M University，Texas 77840，USA）

摘要：輔因子是蛋白質(zhì)或酶結(jié)構(gòu)的重要組成部分，在許多酶的功能中發(fā)揮重要乃至關(guān)鍵作用。在科研和教學(xué)中，現(xiàn)有的輔因子概念及其分類系統(tǒng)不夠清晰準(zhǔn)確。本文從化學(xué)本質(zhì)和功能上將輔因子分為催化型、載體型和底物型3類，并以若干典型的輔因子為例討論輔因子的特異性及再生性等問(wèn)題。

關(guān)鍵詞：輔因子；輔酶；輔基；分類

1 引言

絕大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì)。在蛋白酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，除了氨基酸組成的多肽鏈外，還有很多非蛋白結(jié)構(gòu)，包括金屬離子、有機(jī)小分子、金屬有機(jī)/無(wú)機(jī)配合物等，人們將其統(tǒng)稱為輔因子（cofactor）。這些非蛋白結(jié)構(gòu)與無(wú)活性的蛋白酶前體（即原酶，apoenzyme）結(jié)合構(gòu)成全酶（holoenzyme），共同完成酶的正常生理功能［1］。相關(guān)的酶促反應(yīng)在生物體系中廣泛存在，尤其在合成與代謝有機(jī)分子的生物機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。值得注意的是，除了輔因子之外，全酶中的非蛋白結(jié)構(gòu)還可能是反應(yīng)底物、參與調(diào)節(jié)的信號(hào)分子、氨基酸側(cè)鏈的表達(dá)后修飾或是其他衍生化結(jié)構(gòu)，但只有輔因子能直接參與酶催化反應(yīng)。

輔因子概念最早在20世紀(jì)前期被提出，統(tǒng)稱除蛋白骨架外的所有非蛋白結(jié)構(gòu)，因此在許多早期文獻(xiàn)中，變構(gòu)調(diào)節(jié)的作用位點(diǎn)也被歸入輔因子結(jié)合位點(diǎn)中［2］。隨著對(duì)酶及蛋白結(jié)構(gòu)研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到輔因子應(yīng)當(dāng)是參與酶促反應(yīng)的必需組分，因此將輔因子的概念進(jìn)一步嚴(yán)格化。1997年，國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)給出了輔因子的推薦定義［3］，將其表述為“保持酶活性所必需的有機(jī)分子或離子”，并指出，“輔因子結(jié)合沒(méi)有功能活性的原酶，組成有活性的合酶”。2010年，F(xiàn)ischer等［4］進(jìn)一步提出，輔因子不僅在功能上為活性酶分子所必需，在結(jié)構(gòu)上也應(yīng)結(jié)合到酶催化反應(yīng)的活性中心。因此，從功能上看，輔因子的作用是“全或無(wú)”，而修飾基團(tuán)的作用是“多或少”。即沒(méi)有輔因子，酶無(wú)法發(fā)揮其作用；而沒(méi)有修飾基團(tuán)，只是酶或者相應(yīng)蛋白的活性高低不同。從結(jié)構(gòu)上看，輔因子直接參與催化反應(yīng)區(qū)域（無(wú)論其作為催化劑還是底物），而其他非蛋白結(jié)構(gòu)是局部修飾蛋白、以改變空間結(jié)構(gòu)等方式間接改變酶促反應(yīng)的催化區(qū)域。因此，某些為了穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)而存在的金屬離子或者在變構(gòu)作用中修飾上的磷酸基團(tuán)等，都不能被視為輔因子。

輔因子的分類也經(jīng)歷了一個(gè)發(fā)展歷程。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，輔因子可以根據(jù)其與對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)合的緊密程度分為輔酶和輔基。其中，結(jié)合緊密、不可通過(guò)透析除去者為輔基（prosthetic group）；而結(jié)合松散、可以通過(guò)透析或超濾除去者為輔酶（coenzyme）［5］。考慮到輔酶常常是一些金屬有機(jī)配合物或者有機(jī)小分子，也有人認(rèn)為輔因子是特指無(wú)機(jī)離子或者配合物，輔酶是指有機(jī)金屬化合物，輔基則是指與酶緊密結(jié)合甚至以共價(jià)鍵結(jié)合的輔酶［6］。在很多場(chǎng)合，人們甚至直接用“輔酶”一詞泛指非底物的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。由于非蛋白化合物的結(jié)構(gòu)多樣性，以上幾種分類方法都過(guò)于簡(jiǎn)單，除了區(qū)分輔因子與蛋白結(jié)合的牢固程度外［5，7］，并不能反映輔因子作用的化學(xué)本質(zhì)。隨著生物化學(xué)和生物有機(jī)化學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在科學(xué)界已經(jīng)可以對(duì)大部分輔因子的化學(xué)本質(zhì)與作用機(jī)理進(jìn)行深入描述，從這一角度對(duì)輔因子的功能及其分類進(jìn)行討論，將更符合其內(nèi)在邏輯和學(xué)科發(fā)展趨勢(shì)［8］。例如，歐洲生物信息學(xué)中心建立了輔因子數(shù)據(jù)庫(kù)［9］，并在此基礎(chǔ)上對(duì)輔因子的結(jié)構(gòu)和功能分類進(jìn)行了系統(tǒng)研究。本文基于輔因子功能角度，提出了有益教學(xué)和研究參考的輔因子分類方法。

2 輔因子的功能及其分類概述

輔因子的結(jié)構(gòu)和功能極高的多樣性與其參與酶促反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)有著密切關(guān)系。一般而言，酶的催化作用只能針對(duì)一種或者一類結(jié)構(gòu)非常類似的底物進(jìn)行；而為了催化一類反應(yīng)常常需要特定的輔因子參與。但輔因子并不一定是特異性的，因?yàn)椴煌拿缚梢允褂猛环N輔因子，例如乙醇脫氫酶使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）為輔酶，而乙醛脫氫酶同樣也使用NAD+為輔酶。事實(shí)上，輔因子不僅可以以同樣的催化機(jī)理催化不同類型的反應(yīng)，還可以以不同的催化機(jī)理催化不同的反應(yīng)，甚至還可以作為不同化合物的合成原料參與酶促反應(yīng)。根據(jù)輔因子自身化學(xué)結(jié)構(gòu)與其在酶催化循環(huán)中的作用，我們認(rèn)為輔因子可以從功能上分為3類，如圖1所示。

第一類輔因子作為反應(yīng)的催化劑核心，位于酶的活性中心，是酶催化機(jī)理實(shí)現(xiàn)的必要條件，是催化反應(yīng)所必需的部分，因此相當(dāng)于催化劑本身，我們稱之為催化型輔因子（catalysis-type cofactor）。這類輔因子實(shí)質(zhì)上是彌補(bǔ)了氨基酸結(jié)構(gòu)的局限性，在反應(yīng)（催化循環(huán)）后恢復(fù)原始狀態(tài)。常見的含有金屬輔基以及一些參與催化過(guò)程的輔酶屬于此類。為保證催化中心的穩(wěn)定性，第一類輔因子通常都與蛋白酶的蛋白骨架通過(guò)共價(jià)鍵直接相連。

第二類輔因子常常作為某些被廣泛使用為電子、原子或原子團(tuán)的載體，反應(yīng)（催化循環(huán)）后不能直接恢復(fù)原始狀態(tài)，但可以通過(guò)原反應(yīng)的逆反應(yīng)或其他類似簡(jiǎn)單反應(yīng)實(shí)現(xiàn)恢復(fù)，因此相當(dāng)于一個(gè)特定基團(tuán)的載體，我們稱之為載體型輔因子（carrier-type cofactor）。這類輔因子的另一個(gè)重要特征是一般不與酶進(jìn)行共價(jià)鍵連接，酶的每一個(gè)催化循環(huán)中使用一個(gè)分子并將其轉(zhuǎn)化為其對(duì)應(yīng)產(chǎn)物。該對(duì)應(yīng)產(chǎn)物可以作為其他逆過(guò)程酶的輔因子參與并轉(zhuǎn)化回原來(lái)的輔因子。

第三類輔因子作為某些特定生物活性小分子合成的原料，在反應(yīng)后被消耗，不能直接通過(guò)一步逆反應(yīng)恢復(fù)，需要進(jìn)行復(fù)雜的代謝過(guò)程而實(shí)現(xiàn)重新合成，因此相當(dāng)于酶促反應(yīng)的底物，我們稱之為底物型輔因子（substrate-type cofactor）。需要說(shuō)明的是，同一種輔因子可能同時(shí)屬于上述3類輔因子的一種或者多種，這是輔因子的多功能性決定的。表1中，我們總結(jié)了常見的輔因子及其主要功能和分類。

圖1 常見的輔因子分類

3 催化型輔因子——磷酸吡哆醛類［23］

磷酸吡哆醛（PLP）即維生素B6，是一類非常重要且廣泛存在的輔酶（圖2a）。其關(guān)鍵反應(yīng)位點(diǎn)是吡啶-4-醛基，可以與酶活性位點(diǎn)的氨基以亞胺形式相連，在催化過(guò)程中與底物的氨基反應(yīng)形成底物亞胺（圖2b），而吡啶共軛體系的作用是穩(wěn)定底物-PLP亞胺的α-碳負(fù)離子形式。因此，PLP的主要催化方式是通過(guò)與底物氨基形成亞胺，進(jìn)一步活化α-H以穩(wěn)定α-碳負(fù)離子，其可以催化的反應(yīng)多種多樣。PLP最直接的功能是氨基酸消旋酶（racemase）的主要輔酶，通過(guò)奪取氨基酸的α-H，使得氨基酸經(jīng)過(guò)負(fù)離子中間體而消旋化（圖2c）。PLP也是大多數(shù)脫羧酶的輔酶，可穩(wěn)定氨基酸的脫羧反應(yīng)中間體α-碳負(fù)離子（圖2d）。此外，通過(guò)與氨基酸α-H的交換，底物-PLP亞胺可以水解產(chǎn)生吡哆胺而催化生物轉(zhuǎn)氨反應(yīng)（圖2e）。PLP的例子說(shuō)明，同一種反應(yīng)機(jī)理可以被用到不同酶的不同催化過(guò)程中。

4 載體型輔因子——輔酶NAD類［24］

輔酶NAD類包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）（圖3a），它們具有糖基化煙酰胺（維生素B3）的結(jié)構(gòu)。其中，吡啶環(huán)電子中心是其主要的催化位點(diǎn)（圖3b）。在被H－還原后，氧化型的NAD+將轉(zhuǎn)化為還原型的NADH。從其作用機(jī)理上看，NAD+參與可逆的氧化還原反應(yīng)是其最典型的反應(yīng)。例如NAD+作為乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase）的輔酶，其作用機(jī)理如圖3c所示。其反應(yīng)產(chǎn)物NADH是另外一些還原酶的輔酶，例如提供H－還原碳-碳雙鍵等等，在維生素E以及萜類化合物的合成中都有涉及。

表1 常見的輔因子及其功能分類［2，4］

表1 常見的輔因子及其功能分類［2，4］（續(xù)）

NAD+參與的第二類反應(yīng)是“掩蔽的氧化還原反應(yīng)”（masked redox reaction）。在這類反應(yīng)中，酶通過(guò)NAD+參與的氧化-還原兩步反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物的立體控制或區(qū)域選擇。例如UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶（UDP-glucose-4-epimerase）催化UDP-葡萄糖的4位羥基異構(gòu)化反應(yīng)時(shí)，就利用NAD+將醇氧化為酮得到前手性中心，再通過(guò)控制還原過(guò)程實(shí)現(xiàn)異構(gòu)化（圖4a）。與之類似，3-脫氫奎尼酸合成酶（3-dehydroquinate synthase）催化機(jī)理的關(guān)鍵步驟是脫除磷酸基團(tuán)得到烯醇負(fù)離子，但是正常情況下，用堿脫除α-H相對(duì)比較困難。如果選擇利用其相鄰碳原子上的羥基，則可以通過(guò)將羥基氧化為羰基以增強(qiáng)其α-H的酸性而更容易被脫除，而后續(xù)步驟保持不變（圖4b）。

圖2 PLP通過(guò)與氨基酸的氨基結(jié)合形成亞胺而實(shí)現(xiàn)催化的3類反應(yīng)

NAD+參與的第三類反應(yīng)與其可以形成穩(wěn)定的碳正離子有關(guān)。當(dāng)NAD+中的糖環(huán)采取半縮醛式構(gòu)象時(shí)，2-位上的環(huán)外O―C共價(jià)鍵可以發(fā)生異裂得到碳正離子，并通過(guò)與環(huán)內(nèi)氧原子共軛形成氧鎓離子以穩(wěn)定自身。在組蛋白去乙酰化酶（HDAC）［25］中，NAD+解離得到的碳正離子進(jìn)攻乙?；难踉?，經(jīng)過(guò)多步轉(zhuǎn)化最終實(shí)現(xiàn)脫乙?；▓D4c）。此外，如表1中提到在組氨酸降解代謝中，NAD+在尿刊酶（urocanase）催化下作為親電中心接受咪唑環(huán)親核進(jìn)攻，最終導(dǎo)致穩(wěn)定的咪唑環(huán)系被羥基化而破壞［26］（圖4d）。由此可見，NAD+實(shí)際上催化的反應(yīng)多種多樣，參與氧化酶的催化過(guò)程和間接的氧化催化都體現(xiàn)了載體型輔因子的特點(diǎn)；同時(shí)，它還保留了糖環(huán)衍生物的特點(diǎn)。

圖3 NAD+的結(jié)構(gòu)與基本氧化催化機(jī)理

5 底物型輔因子——SAM類［27］

SAM的結(jié)構(gòu)如圖5a所示，中心锍離子的S―C鍵可以異裂而轉(zhuǎn)移碳正離子，主要作為很多重要生物活性分子合成的甲基化試劑，或在自由基-SAM酶體系中作為自由基引發(fā)劑。SAM可以參與多類生物合成反應(yīng)，如圖5所示。第一類反應(yīng)是最直接的，通過(guò)轉(zhuǎn)移碳正離子實(shí)現(xiàn)甲基化（圖5a）。第二類反應(yīng)是利用甲硫氨酸產(chǎn)生的γ-碳正離子進(jìn)行的反應(yīng)。例如利用羧基進(jìn)攻該γ-碳正離子得到α-氨基丁內(nèi)酰胺，而α-氨基丁內(nèi)酰胺是進(jìn)一步合成細(xì)菌群體效應(yīng)信號(hào)分子（quorum sensor）的一種原料（圖5b）。再如在α-氨基環(huán)丙基羧酸（ACC）的生物合成中，SAM在ACC合成酶的催化下轉(zhuǎn)化為ACC（圖5c）。利用甲硫氨酸γ-碳正離子還可以合成一些重要的寡聚物或者高聚物。例如，SAM可以由氨基進(jìn)攻γ-碳正離子形成寡聚氨基酸，而后者是合成重要的鐵螯合劑（siderophore）類化合物的原料（圖5d）。此外，SAM也可以首先在SAM脫羧酶催化下脫羧，然后再發(fā)生氨基進(jìn)攻γ-碳正離子聚合形成多胺類化合物（圖5e）。SAM的第三類反應(yīng)發(fā)生在核糖環(huán)系，例如在氟乙酸的生物合成過(guò)程中，第一步是氟離子進(jìn)攻核糖-5-碳正離子而解離甲硫氨酸，含氟的糖環(huán)經(jīng)過(guò)多步重排反應(yīng)最終形成氟乙酸（圖5f）。

6 結(jié)論

本文對(duì)輔因子、輔酶、輔基等概念進(jìn)行總結(jié)，基于輔因子的化學(xué)本質(zhì)將其分為催化型輔因子、載體型輔因子和底物型輔因子3類；對(duì)已知的大多數(shù)輔因子都進(jìn)行了歸類總結(jié)，并進(jìn)一步結(jié)合若干實(shí)例探討了輔酶催化機(jī)理與催化反應(yīng)多樣性等問(wèn)題。隨著新的非蛋白結(jié)構(gòu)的不斷發(fā)現(xiàn)，以及人們對(duì)現(xiàn)有輔因子的深入研究［28］，相信本文的分類系統(tǒng)能夠?qū)虒W(xué)及實(shí)際應(yīng)用提供幫助。

感謝康奈爾大學(xué)博士生王淼參與討論和提出的建議。

圖4 以NAD+為輔酶的一些酶促過(guò)程

圖5 SAM作為反應(yīng)底物參與的幾類典型反應(yīng)

參考文獻(xiàn)

［1］鄭穗平，郭 勇，潘 力.酶學(xué).第2版.北京:科學(xué)出版社，2009.

［2］Larsson，A.；Reichard，P.J.Bio.Chem.1966，241，2533.

［3］ McNaught，A.D.；Wilkinson，A.IUPAC Compendium of Chemical Terminology，2nd ed.；Blackwell Scientific Publications:Oxford，1997.

［4］Fischer，J.D.；Holliday，G.L.；Rahman，S.A.；Thornton，J.M.J.Mol.Biol.2010，403，803.

［5］王鏡巖，朱圣庚，徐長(zhǎng)達(dá).生物化學(xué)（上冊(cè)）.北京:科學(xué)出版社，2002.

［6］Nelson，D.Lehninger Principles of Biochemistry；W.H.Freeman and Company:New York，2008.

［7］鄒國(guó)林，朱汝璠.酶學(xué).武漢:武漢大學(xué)出版社，1997.

［8］Kulkarni，N.S.；Deshpande，M.S.General Enzymology；Himalaya Pub.House:Mumbai，India，2007.

［9］Fischer，J.D.；Holliday，G.L.；Thornton，J.M.Bioinformatics 2010，26，2496.

［10］Benkovic，S.J.Annu.Rev.Biochem.1980，49，227.

［11］Rétey，J.Arch.Biochem.Biophys.1994，314，1.

［12］Stenflo，J.；Suttie，J.W.Annu.Rev.Biochem.1977，46，157.

［13］ Murphy，M.J.；Siegel，L.M.；Tove，S.R.；Kamin，H.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1974，71，612.

［14］Vorholt，J.A.；Thauer，R.K.Eur.J.Biochem.1997，248，919.

［15］Noll，K.M.；Rinehart，K.L.；Tanner，R.S.；Wolfe，R.S.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1986，83，4238.

［16］Jordan，P.M.；Warren，M.J.FEBS Lett.1987，225，87.

［17］Negishi，M.；Pedersen，L.G.；Petrotchenko，E.；Shevtsov，S.；Gorokhov，A.；Kakuta，Y.；Pedersen，L.C.Arch.Biochem.Biophys.2001，390，149.

［18］Mendel，R.R.；H?nsch，R.J.Exp.Bot.2002，53，1689.

［19］ Ginsburg，V.Progress in Clinical and Biological Research 1977，23，595.

［20］Salisbury，S.A.；Forrest，H.S.；Cruse，W.B.T.；Kennard，O.Nature 1979，280，843.

［21］Johannis，A.D.Eur.J.Biochem.1991，200，271.

［22］ Schomburg，D.；Salzmann，M.Enzyme Handbook 1；Springer:New York，1990；pp 991.

［23］Toney，M.D.Wiley Encyclopedia of Chemical Biology；John Wiley&Sons，Inc.:New York，2008.

［24］ Belenky，P.；Bogan，K.L.；Brenner，C.Trends Biochem.Sci.2007，32，12.

［25］Chang，J.H.；Kim，H.C.；Hwang，K.Y.；Lee，J.W.；Jackson，S.P.；Bell，S.D.；Cho，Y.J.Bio.Chem.2002，277，34489.

［26］Rétey，J.Arch.Biochem.Biophys.1994，314，1.

［27］Mato，J.M.；Lu，S.C.Hepatology 2007，45，1306.

［28］Bogerd，H.P.；Fridell，R.A.；Madore，S.；Cullen，B.R.Cell 1995，82，485.

中圖分類號(hào)：O6；G64

doi:10.3866/PKU.DXHX20160439www.dxhx.pku.edu.cn

*通訊作者，Email:dengg13@mails.tsinghua.edu.cn

Discussion and Classification of Cofactors Based on Their Chemical Essences and Functions

WANGA.Zhipeng1，2DENG Geng1，*
（1Department of Chemistry，Tsinghua University，Beijing 100086，P.R.China；
2Department of Chemistry，Texas A&M University，Texas 77840，USA）

Abstract:Cofactors are vital parts of proteins and enzymes，which play remarkably significant roles in the functional realization of enzyme catalyzing processes.However，in current study system of cofactors，the definition and classification are not clear enough.In this article，we suggest to divide the various cofactors into three major groups:catalysis-type cofactors，carrier-type cofactors，and substrate-type cofactors according to their chemical essences and catalytic mechanisms，followed by the discussion of several typical cofactor examples to demonstrate the specificity and regeneration of cofactors.

Key Words:Cofactor；Coenzyme；Prosthetic group；Classification