劉振杰，曹永堅，岑子華，徐　寧△

(1.廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院檢驗科，廣州 510370；2.中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院2008級醫(yī)學(xué)檢驗，廣州 510080)

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·論著·

慢性乙型肝炎患者病毒基因組與乙型肝炎病毒e抗原、肝功能關(guān)系分析

劉振杰1，曹永堅1，岑子華2，徐寧1△

(1.廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院檢驗科，廣州 510370；2.中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院2008級醫(yī)學(xué)檢驗，廣州 510080)

摘要:目的探討乙型肝炎病毒基因組 (HBV-DNA)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、肝功能的相關(guān)關(guān)系，為臨床治療提供參考。方法回顧分析401例患者的HBV-DNA、HBeAg、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平，對HBV-DNA與HBeAg進(jìn)行相關(guān)性分析。根據(jù)患者的HBV-DNA、HBeAg水平進(jìn)行分組，比較各組的ALT、AST水平差異。結(jié)果(1)HBV-DNA與HBeAg的陽性率存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.671(P<0.01)；(2)HBV-DNA載量達(dá)105 copies/mL時，血清ALT、AST較HBV-DNA陰性組及低載量組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(3)在HBV-DNA載量相當(dāng)時，HBeAg陽性組與陰性組ALT、AST活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論(1)HBeAg與HBV-DNA具有相關(guān)性；(2) HBV-DNA載量較高的患者容易出現(xiàn)肝功能異常；(3)HBeAg的存在情況與肝功能無顯著相關(guān)性。

關(guān)鍵詞:乙型肝炎病毒基因組；乙型肝炎病毒e抗原；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶

乙型肝炎是一種常見傳染病，據(jù)估計全球3.5億人感染乙型肝炎病毒(HBV)，HBV與肝硬化、原發(fā)性肝癌密切相關(guān)，每年有一百萬人死于有關(guān)疾病[1]。目前，認(rèn)為乙型肝炎對肝的損害是由于HBV引起細(xì)胞免疫針對受感染肝細(xì)胞的清除，病情的轉(zhuǎn)歸涉及HBV的體內(nèi)復(fù)制情況和機體的免疫狀況。HBV基因組(HBV-DNA)載量、HBV血清標(biāo)志物和血清轉(zhuǎn)氨酶是監(jiān)測HBV感染情況的常用指標(biāo)。了解三者之間的相關(guān)關(guān)系及臨床應(yīng)用的代表性有其意義。本文旨在研究三者在慢性乙型肝炎患者中的聯(lián)系，為臨床提供指導(dǎo)意義。

1資料與方法

1.1一般資料401例血清標(biāo)本收集自2013年2月1日至2013年3月15日在廣東省中醫(yī)院系統(tǒng)(包含大德路總院、芳村分院、二沙島分院、大學(xué)城分院)同時作HBV-DNA、乙型肝炎兩對半定量、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測的門診及住院患者，排除溶血、黃疸、脂血標(biāo)本。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《慢性乙型肝炎防治指南(2010版)》[2]。其中男273例，女128例，年齡12～77歲，平均(37±12)歲。

1.2儀器與試劑血清ALT、AST由兩套檢測系統(tǒng)測定：羅氏Modular全自動生化分析位儀購自德國羅氏公司，采用羅氏配套試劑、校準(zhǔn)品、伯樂質(zhì)控品；羅氏Cobas 8000全自動生化分析儀，采用配套試劑、校準(zhǔn)品、伯樂質(zhì)控品。兩套系統(tǒng)均通過室間質(zhì)評；ABI 7300自動基因擴增檢測儀購自美國ABI公司，HBV-DNA熒光定量試劑盒由廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)；羅氏e 601化學(xué)發(fā)光分析儀購自德國羅氏公司，采用羅氏配套試劑、校準(zhǔn)品、伯樂質(zhì)控品。

1.3方法

1.3.1ALT活性測定以速率法測定。ALT催化L-丙氨酸和2-酮戊二酸產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)存在下生成L-乳酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，NADH的反應(yīng)速率與ALT的活性成正比，在340 nm波長處可檢測到吸亮度的降低。測試系統(tǒng)以測定值大于50 IU/L為陽性。

1.3.2AST活性測定以速率法測定。AST催化L-精氨酸與天門冬氨酸產(chǎn)生L-谷氨酸與草酰乙酸，草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶存在下與NADH反應(yīng)生成L-乳酸和NAD，反應(yīng)速率和AST的活性成正比，在340 nm波長處檢測到吸亮度的降低。AST測試系統(tǒng)以測定值大于40 IU/L為陽性。

1.3.3血清HBVe抗原(HBeAg)定量測定用電化學(xué)發(fā)光法測定。測試原理利用雙抗體夾心法，先將待測血清、生物素化抗HBeAg單克隆抗體、釕標(biāo)記抗乙型肝炎e(HBe)混合，形成夾心復(fù)合物，再加入鏈霉素親和素微粒，通過生物素-親和素結(jié)合使微粒結(jié)合在復(fù)合物上，在測量池中用磁鐵吸附復(fù)合物，同時洗去未形成復(fù)合物，加電壓發(fā)光并由光電倍增管檢測，通過計算器運算結(jié)果，以cut-off值大于或等于1判為陽性。

1.3.4乙型肝炎DNA定量測定用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測定。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，主要技術(shù)步驟為血清中HBV-DNA提取，PCR反應(yīng)條件為93 ℃ 2 s→93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s進(jìn)行10次循環(huán)，再以93 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s進(jìn)行30次循環(huán)。以HBV-DNA≥500 copies/mL作陽性判斷臨界值。以HBV-DNA載量分為3個水平：DNA陰性組 (HBV-DNA<500 copies/mL)、DNA低載量組(500 copies/mL≤HBV-DNA<105copies/mL)、DNA高載量組(HBV-DNA≥105copies/mL)；同時以HBeAg定性結(jié)果分為HBeAg陽性組(S/CO≥1)和HBeAg陰性組(S/CO<1)，共6組。

1.3.5數(shù)據(jù)查詢登錄怡捷實驗室數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，以1.1中標(biāo)準(zhǔn)查詢并記錄患者的ALT、AST、HBeAg定量及HBV-DNA定量檢測結(jié)果。

2結(jié)果

2.1HBeAg陽性率與HBV-DNA陽性率的關(guān)系HBeAg陽性200例，其中HBV-DNA陽性121例，HBV-DNA陰性79例；HBeAg陰性201例，其中HBV-DNA陽性69例，HBV-DNA陰性132例。兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.54，P<0.01)，兩者的陽性率相關(guān)。

2.2HBeAg定量與HBV-DNA定量的相關(guān)關(guān)系為進(jìn)一步研究兩者間的相互關(guān)系，以HBV-DNA定量和HBeAg定量作統(tǒng)計量，計算兩者Pearsons相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示兩者之間相關(guān)系數(shù)r=0.671(P<0.01)。

2.3ALT、AST與HBeAg、HBV-DNA載量關(guān)系分析經(jīng)t檢驗后，無論HBeAg陽性或陰性，HBV-DNA低載量與HBV-DNA陰性組相比，ALT、AST差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；HBV-DNA高載量與HBV-DNA陰性組、HBV-DNA低載量組相比，ALT、AST差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在HBeAg定性結(jié)果不同但同等病毒載量下，各組相比，ALT、AST差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　不同載量HBV-DNA及HBeAg組ALT、AST的水平

續(xù)表1　不同載量HBV-DNA及HBeAg組ALT、AST的水平

3討論

目前，HBV-DNA檢測是最特異的針對HBV在體內(nèi)復(fù)制情況的指標(biāo)，但由于其成本較高，對儀器設(shè)備要求苛刻的關(guān)系，部分醫(yī)療機構(gòu)難以推廣。血清轉(zhuǎn)氨酶和乙型肝炎血清標(biāo)志物均是與乙型肝炎密切相關(guān)的指示物，方法學(xué)上更簡單，應(yīng)用較廣，但兩者代替HBV-DNA的監(jiān)察作用的合理性則存在疑問。本文對HBeAg與HBV-DNA的相互關(guān)系作出分析，發(fā)現(xiàn)HBV-DNA檢測結(jié)果為陽性的患者，其HBeAg檢測陽性率高于HBV-DNA檢測結(jié)果為陰性的患者，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明HBV-DNA與HBeAg的發(fā)生率具有相關(guān)性。在進(jìn)一步的相關(guān)性檢驗中，以兩者的絕對數(shù)量為坐標(biāo)軸作散點圖，統(tǒng)計后得出兩者的Pearsons相關(guān)系數(shù)r=0.671(P<0.01)，說明兩者在數(shù)量上呈正相關(guān)。有報道指出，高病毒負(fù)荷的患者易轉(zhuǎn)慢性化[3-4]，而Milich等[5]的研究指出，HBeAg的存在能干擾CD8-CTL的細(xì)胞毒作用，誘導(dǎo)機體對HBV的免疫耐受，兩者指出HBV-DNA和HBeAg對乙型肝炎慢性化都具有預(yù)警作用，而此結(jié)果顯示以HBeAg作為HBV-DNA復(fù)制的指標(biāo)的確有一定根據(jù)，在缺乏其他資料支持下，HBeAg具有提示的作用?？v然如此，建立HBeAg與HBV-DNA的關(guān)系仍有不少問題目前難以克服，從相關(guān)性分析中可得知兩者數(shù)量不構(gòu)成平行關(guān)系。本研究中發(fā)現(xiàn)，79例HBeAg陽性患者HBV-DNA水平為陰性，可能與慢性乙型肝炎的自然病史有關(guān)，在免疫清除期后期或低活動期前期機體免疫系統(tǒng)被激活，開始清除病毒顆粒，結(jié)果是病毒載量的減少。同時，血清轉(zhuǎn)換在該時期尚未完成，患者仍然表達(dá)HBeAg[6]。利用HBeAg的另一盲點是無法評估HBeAg陰性乙型肝炎患者。由于HBV轉(zhuǎn)錄酶缺乏修飾功能，翻譯中易發(fā)生突變。HBeAg可有數(shù)種途徑，主要的有：(1)前C區(qū)的1 896位的G-A變異，使終止子抗胸腺球蛋白出現(xiàn)，病毒不能表達(dá)HBeAg，但并不影響DNA的復(fù)制[7]；(2)HBeAg表達(dá)水平降低，核心啟動子區(qū)存在T1462A和T1464A突變，使HBeAg表達(dá)水平大幅下降。以上突變只影響HBeAg的表達(dá)，并不影響HBV的復(fù)制，無法以HBeAg來說明HBV的復(fù)制情況[8]。有報道指出，HBeAg的陰性化有利于HBV逃過免疫機制[9]。一項流行調(diào)查指這類患者占總體患者21%～40%[7]。

另外，臨床常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)大規(guī)模篩查可疑人群，而并非本文所用的電化學(xué)發(fā)光法。有報道指出，以電化學(xué)發(fā)光對HBeAg的最低檢測限可達(dá)比ELISA高10倍以上[10]，可預(yù)期以ELISA作大規(guī)模篩查，其漏檢情況更為普遍，失去提示作用，值得留意。

有關(guān)肝功能與乙型肝炎血清標(biāo)志物及HBV-DNA之間的關(guān)系，不少數(shù)據(jù)曾對此作出分析，但結(jié)論分歧。本文中亦以HBV-DNA的絕對數(shù)量及HBeAg的定性檢測結(jié)果分組，以便觀察各基因組水平及同等基因組水平下肝損害的情況。結(jié)果顯示不論基因組載量的高低，在相同HBV-DNA水平下，HBeAg陽性組與HBeAg陰性組的血清ALT、AST均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明HBeAg不影響血清ALT、AST水平，沒有反映肝細(xì)胞的實質(zhì)損害作用。究其原因，據(jù)文獻(xiàn)[11-12]的報道，人體對HBV的免疫作用主要為細(xì)胞免疫，主要作用細(xì)胞是CD4Th細(xì)胞和CD8-CTL細(xì)胞，雖然HBeAg能成為CTL的靶抗原，但其不是結(jié)構(gòu)蛋白，因此其作用主要是免疫耐受調(diào)節(jié)因子，不直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[13-15]。因此，HBeAg并非血清轉(zhuǎn)氨酶異常升高的主因。文中同時研究HBV-DNA載量對肝功能的影響，結(jié)果說明在HBeAg定性檢測結(jié)果一致的情況下，不論在HBeAg陽性組與HBeAg陰性組里，都存在同樣現(xiàn)象：在HBV-DNA為陰性或水平較低(<105copies/mL)時，HBV-DNA與肝損害致ALT、AST在血中存在的關(guān)系不明顯(P>0.05)；當(dāng)HBV-DNA達(dá)到一定水平(>105copies/mL)時，基因組復(fù)制水平與肝功能之間有關(guān)(P<0.05)，HBV-DNA載量較高時，肝損害亦會加重，這與文獻(xiàn)[16-18]報道一致。

綜上所述，HBV-DNA、HBeAg和血清轉(zhuǎn)氨酶三者分別從病毒的復(fù)制水平、免疫應(yīng)答和肝細(xì)胞損害反映機體感染HBV后的狀況。隨著HBeAg陰性乙型肝炎的發(fā)現(xiàn)和乙型肝炎患者肝細(xì)胞損害的機制的了解，對三者之間是否存在緊密聯(lián)系提出了質(zhì)疑。本研究結(jié)果顯示，用血清轉(zhuǎn)氨酶和HBeAg代替HBV-DNA作為檢測HBV的活動指標(biāo)并不是完全沒有依據(jù)，但臨床應(yīng)用中具有很大的局限性，并不能如實反映HBV的復(fù)制情況及傳染性，因此同時作3種檢查有其必要性。

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作者簡介：劉振杰，男，主管技師，主要從事臨床免疫學(xué)研究。△通訊作者，E-mail:xu_ning21@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.015

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1784-03

(收稿日期：2016-02-18修回日期：2016-04-30)

Analysis on relation between viral genome with hepatitis B virus e antigen and liver function in chronic hepatitis B patients

LIUZhenjie1,CAOYongjian1,CENZihua2,XUNing1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,FangcunHospital,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510370,China;2.Grade2008,DepartmentofMedicalLaboratory,SunYatsenUniversity,Guangzhou,Guangdong510080,China)

Abstract:ObjectiveTo study the relationship among hepatitis B viral genome (HBV-DNA),hepatitis Be antigen(HBeAg) and liver function in chronic hepatitis B patients,and to provide the reference for clinical treatment.MethodsThe quantitative levels of HBV-DNA,HBeAg,alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase(AST) in 401 patients were analyzed and the correlation analysis between HBV-DNA and HBeAg was performed.The grouping was performed according to the HBV-DNA and HBeAg quantitative levels and the differences of ALT and AST levels were compared among the groups.Results(1) The correlation existed between HBV-DNA and HBeAg positive rate,r=0.671(P<0.01);(2)when HBV-DNA load reaching 105 copies/mL,serum ALT and AST levels showed significantly increased compared with the HBV-DNA negative group and low load group,the difference was statistically significant(P<0.05);(3)when HBV-DNA load was equivalent,the difference of ALT and AST activity had no statistically significant difference between the HBeAg-positive and HBeAg-negative groups.Conclusion(1)HBeAg has a correlation with HBV-DNA;(2)the patients with higher HBV-DNA load are easy to develop the liver function abnormality;(3)the HbeAg existence situation has no obvious relation with the liver function.

Key words:hepatitis B viral genome;HBV e antigens;alanine aminotransferase;aspartate aminotransferase