李龍明，李明，2，黎韻琪，黃結(jié)雯，馬婷玉，吳燕燕

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不同連栽年限對廣藿香植株生長及其藥材品質(zhì)的影響

李龍明1，李明1，2，黎韻琪1，黃結(jié)雯1，馬婷玉1，吳燕燕1

（1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州510006；2.國家中醫(yī)藥管理局 嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室，廣東廣州510006）

摘要：目的研究不同連栽年限對廣藿香植株農(nóng)藝性狀、生理生化指標及主要有效成分質(zhì)量分數(shù)的影響，為揭示廣藿香連作障礙成因提供依據(jù)。方法采用田間調(diào)查研究法，對廣東藥科大學藥用植物園的栽培當年、連栽1 a、連栽2 a的廣藿香植株進行研究。結(jié)果不同連栽年限對廣藿香株高、葉面積、根系活力、總?cè)~綠素質(zhì)量分數(shù)及其根、莖、葉的過氧化物酶、超氧化物歧化酶及過氧化氫酶均具有一定的抑制作用，且隨連栽年限延長抑制作用增強；廣藿香根、莖、葉中丙二醛（MDA）質(zhì)量摩爾濃度隨著連栽年限的延長而增加，其百秋李醇與總揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)則隨連栽年限延長而降低。結(jié)論連栽對廣藿香植株的生長、抗氧化酶活性、總揮發(fā)油、百秋里醇積累產(chǎn)生一定程度的抑制影響。

關鍵詞：廣藿香；連栽障礙；生長；品質(zhì)

網(wǎng)絡出版時間：2016-06-12 15：18 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.r.20160612.1518.004.html

單一樹種長期連續(xù)生長或者多代連栽（砍伐樹干以上部分，留下樹根萌芽下一代）后容易出現(xiàn)自衰或自毒等土壤退化和林木生長發(fā)育不良的現(xiàn)象，從而造成人工純林連栽障礙［1］。由于作物或者藥用植物的采收時間較短，采收后往往栽種下一茬，因此可以認為連栽障礙是作物或者藥用植物連作障礙的一種特殊形式。許多多年生藥用植物如丹參［2］、三七［3］等藥用植物均出現(xiàn)了植株發(fā)育不良、藥材產(chǎn)量降低、病蟲害加重、根部畸形生長甚至腐爛等連作障礙現(xiàn)象，與其多年連栽栽培產(chǎn)生的影響有密切關系，主要由土壤理化性狀改變、土壤生物學環(huán)境惡化及植物自毒作用3個因素導致［4］。

廣藿香Pogostemon cablin（blanco）benth.為唇形科刺蕊草屬草本植物，地上部分入藥［5］，也可用于提煉廣藿香精油。近年來醫(yī)藥和精油市場對廣藿香的需求有逐年增加的趨勢，但在其栽培生產(chǎn)過程中出現(xiàn)了嚴重的連作障礙問題，導致廣藿香出現(xiàn)植株生長緩慢、葉小而黃、根部腐爛變褐、病害頻發(fā)等現(xiàn)象，可能與廣藿香連作土壤中隨栽培年限延長而積累了大量的自毒物質(zhì)與致病菌有關［6-7］。廣藿香通常一年采收，再植下茬出現(xiàn)嚴重的連作障礙。為了研究廣藿香的連作障礙，本文通過調(diào)查研究不同連栽年限的廣藿香植株生長、抗氧化酶活性、光合色素、根系活力以及有效成分質(zhì)量分數(shù)，旨在探究連栽對廣藿香生長及品質(zhì)的危害，為進一步揭示連作障礙對廣藿香的影響及其作用機制提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2450紫外分光光度計（日本島津公司）；揮發(fā)油提取器；GC7890（FID）氣相色譜儀（上海天美科學儀器有限公司）。

廣藿香為采自廣東藥科大學大學城校區(qū)藥用植物園的栽培當年、連栽1 a和連栽2 a的廣藿香成熟植株，經(jīng)本校中藥學院李明教授鑒定為唇形科植物廣藿香Pogostemon cablin（blanco）benth.（3批樣品自編批號分別為ZP-20150621、LZ1-20150621、LZ2-20150621）；百秋李醇對照品（批號：110772-201407）購于廣東省食品藥品檢驗所；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樣本處理

在廣藿香種植地上采用5點采樣法［8］，分別對栽培當年、連栽1 a和連栽2 a的廣藿香植株進行隨機采樣，每點采集1株作為調(diào)查樣本，然后清除泥土沙石等雜物，重復3次，待測。

2.2 農(nóng)藝性狀的測定

分別對栽培當年、連栽1 a和連栽2 a廣藿香植株的株高、鮮質(zhì)量、根長、根數(shù)及葉面積等農(nóng)藝性狀進行生物測定［9］，重復3次。

2.3 葉綠素質(zhì)量分數(shù)、根系活力和丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的測定

測定廣藿香幼苗葉片葉綠素質(zhì)量分數(shù)［10］；采用氯化三苯基四氮（TTC）法［11］測定幼苗的根系活力；測定廣藿香幼苗的根、莖、葉中丙二醛（MDA）的質(zhì)量摩爾濃度［10］。

2.4 酶活性的測定

分別測定不同連栽年限廣藿香根、莖、葉中過氧化物酶（POD）［11］、過氧化氫酶（CAT）［11］、超氧化物歧化酶（SOD）［12］的活性，試驗每組各重復3次。

2.5 總揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)的測定［13］

參照2015年版《中國藥典》第四部揮發(fā)油測定法（通則2204-甲法）測定各處理廣藿香植株中總揮發(fā)油的質(zhì)量分數(shù)，按公式“w（揮發(fā)油）=揮發(fā)油讀數(shù)/藥材質(zhì)量（干品）×100%”計算供試廣藿香植株中總揮發(fā)油的質(zhì)量分數(shù)。

2.6 百秋李醇質(zhì)量分數(shù)的測定［5］

參照2015年版《中國藥典》一部［廣藿香］項下百秋李醇質(zhì)量分數(shù)的測定方法（通則0521）測定各處理廣藿香植株中百秋李醇的質(zhì)量分數(shù)。

內(nèi)標溶液的制備：取正十八烷適量，精密稱定，加正己烷制成每1 mL含3.0 mg的溶液作為內(nèi)標溶液（30 mg正十八烷定容至10 mL）。

對照品溶液的制備：精密稱取百秋李醇對照品20 mg，精密加入3 mg/mL正十八烷內(nèi)標溶液1 mL，用正己烷定容至10 mL，得對照品溶液，備用。

供試品溶液的制備：將陰干后的廣藿香植株地上部分粉碎，過60目篩，再精密稱取廣藿香粗粉1.0 g，置于錐形瓶中，加三氯甲烷50 mL，超聲處理3次，每次20 min，濾過，合并濾液，回收溶劑至干，殘渣加正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液 0.5 mL，再加正己烷至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，得供試品溶液，備用。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析（on-way ANOVA）對以上數(shù)據(jù)進行樣品間差異的顯著性檢驗（α= 0.05），并使用Duncan新復極差法進行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同連栽年限對廣藿香植株農(nóng)藝性狀、根系活力及總?cè)~綠素質(zhì)量分數(shù)的影響

各處理廣藿香植株的農(nóng)藝性狀、根系活力及總?cè)~綠素質(zhì)量分數(shù)的試驗結(jié)果如表1所示。

廣藿香連栽1、2 a的植株鮮質(zhì)量、根長及根數(shù)較當年生植株的有所增長，但其株高、葉面積、根系活力和總?cè)~綠素質(zhì)量分數(shù)隨連栽年限增長均呈降低的變化。與廣藿香當年生植株相比，連栽2 a植株的株高、葉面積、根系活力和總?cè)~綠素質(zhì)量分數(shù)最低，分別降低了12.39%、62.40%、66.67%和45.71%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3.2 不同連栽年限對廣藿香植株抗氧化酶活性及MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

不同連栽年限廣藿香根、莖、葉中POD、CAT、SOD的活性及MDA質(zhì)量摩爾濃度測定結(jié)果見表2。

由表2可知，其根、莖、葉的POD活性隨著連栽年限的增加均呈現(xiàn)降低的變化趨勢。與廣藿香當年生植株相比，連栽1 a植株中葉片POD活性差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），降低了26.19%；連栽2 a植株的根部和葉片POD活性較當年植株的相應值分別降低了59.92%和66.72%（P＜0.05）。

連栽廣藿香根、莖、葉CAT活性隨著連栽年限的增加均呈現(xiàn)降低的變化，與當年植株比較，連栽1、2 a植株的根、莖、葉CAT差異活性均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），連栽2 a植株的根、莖、葉CAT活性降至最低水平，較當年植株的相應值分別降低了61.04%、32.08%、66.76%（P＜0.05）。

連栽廣藿香根、莖、葉SOD活性隨著連栽年限的增加均呈現(xiàn)降低趨勢。與當年植株比較，連栽1 a植株的根、莖、葉SOD活性略有下降，連栽2 a植株根、莖、葉的SOD活性降至最低水平，較當年植株分別降低了23.58%、13.87%、38.19%（P＜0.05）。

廣藿香連栽后，其根、莖、葉的MDA質(zhì)量摩爾濃度隨連栽年限的增加而呈現(xiàn)增大趨勢。與廣藿香當年生植株相比，連栽1 a植株的根、莖、葉中MDA質(zhì)量摩爾濃度稍有增大，連栽2 a植株的根、莖、葉MDA質(zhì)量摩爾濃度達到最高水平，較當年植株相應值分別增加了39.47%、23.08%、124.14%（P＜0.05）。

3.3 不同連栽年限對廣藿香植株百秋李醇及總揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)的影響

測定不同連栽年限廣藿香植株中百秋李醇及總揮發(fā)油的質(zhì)量分數(shù)，方法學考察如下。

表1 連栽對廣藿香植株農(nóng)藝性狀、根系活力及總?cè)~綠素質(zhì)量分數(shù)的影響Table 1 Effect of continuous cropping years on the agronomic traits，root activity and total chlorophyll contents of P.cablin

表2 連栽對廣藿香植株抗氧化酶活性及MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響Table 2 Effect of continuous cropping years on antioxidase activity and MDA content of P.cablin

3.3.1 標準曲線的繪制 分別精密量取百秋李醇對照品溶液0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于5 mL容量瓶中，注入內(nèi)標溶液200 μL，用正己烷稀釋至刻度，制得百秋李醇質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL的對照品溶液。分別精密取1 μL注入氣相色譜儀，每個質(zhì)量濃度分別進樣5次，去除每組數(shù)據(jù)的最大值和最小值后取平均值，以百秋李醇峰面積和正十八烷峰面積比值為縱坐標（Y），百秋李醇質(zhì)量濃度為橫坐標（X）做標準曲線，得回歸方程Y=1.657 9X+0.016 4（r=0.999 5），說明百秋李醇質(zhì)量濃度在0.059 19～1.994 3 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

3.3.2 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號：ZP-20150621）1 μL，重復進樣6次，依法測定，計算百秋李醇峰面積與正十八烷峰面積的比值，結(jié)果其平均值為0.561，RSD值為1.56%，表明儀器的精密度良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗 分別在制備后0、2、4、6、8、24 h精密吸取同一供試品溶液（批號：ZP-20150621）1 μL，依法測定，計算百秋李醇與正十八烷峰面積的比值，結(jié)果平均值為0.650，RSD值為1.26%，表明24 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

3.3.4 重復性試驗 取同一批（批號：ZP-20150621）廣藿香6份，精密稱定，按“2.6”項下方法制備供試品溶液，并依法測定百秋李醇質(zhì)量分數(shù)，計算百秋李醇與正十八烷峰面積的比值，結(jié)果其平均值為0.604，RSD值為1.94%，表明本方法重復性良好。

3.3.5 加樣回收率試驗 取已知百秋李醇質(zhì)量分數(shù)的同一批（批號：ZP-20150621）廣藿香樣品，約1 g，精密稱定，共6份。分別加入百秋李醇對照品溶液5 mL，依法測定，計算得百秋李醇加樣回收率平均值為98.52%，RSD值為1.86%。見表3。

表3 廣藿香中百秋李醇的加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Table 3 Recovery results of patchouli alcohol in P.cablin

3.3.6 連栽廣藿香植株中百秋李醇及總揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)的測定結(jié)果 隨著連栽年限增加，廣藿香植株中百秋李醇質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)降低趨勢。與當年生植株相比，連栽1 a廣藿香植株中百秋李醇質(zhì)量分數(shù)略有下降，連栽2 a植株中百秋李醇質(zhì)量分數(shù)較當年植株降低了42.39%（P＜0.05），見表4。百秋李醇對照品，栽培當年，連栽1、2 a廣藿香色譜圖見圖1。

總揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)的高低是評價廣藿香藥材品質(zhì)的重要指標之一，廣藿香植株總揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)隨連栽年限升高亦呈現(xiàn)降低的變化，見表4。與當年生植株相比，連栽1、2 a植株的總揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)依次降低了26.67%、50.0%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 連栽對廣藿香植株百秋李醇及總揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)的影響Table 4 Effect of continuous cropping years on the contents ofpatchouli alcohol and total volatile oil of P.cablin

1.百秋李醇；2.內(nèi)標物正十八烷。圖1 百秋李醇對照品（A），栽培當年（B）、連栽1 a（C）、連栽2 a廣藿香（D）供試品溶液的GC圖Figure 1 GC-Chromatograms of patchouli alcohol of patchouli alcohol reference substance（A），the sample of planting year（B），continuous cropping for a year（C）and two years of P.cablin（D）

4 討論

研究表明，化感自毒作用可能是導致連作障礙的重要因素。廣藿香存在嚴重的連作障礙，課題組前期研究表明，廣藿香根際土壤、根系分泌物、根際土壤水浸液對其扦插苗或組培苗均具有化感自毒作用［9，14-15］。植物土壤的化感物質(zhì)及土壤微生物組成和區(qū)系的變化是導致連作障礙的重要因素［16］，課題組近期通過檢測廣藿香連栽土壤水浸液的幾種酚酸類物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)發(fā)現(xiàn)，連栽導致廣藿香根際土壤酚酸類物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)升高；廣藿香連作會導致其后茬土壤的微生物區(qū)系和土壤酶活性發(fā)生變化，并對后茬植株的生長、生理指標及有效成分質(zhì)量分數(shù)產(chǎn)生抑制作用。

本文通過對栽培當年、連栽1、2 a的廣藿香生長狀況進行調(diào)查，結(jié)果表明，隨著連栽年限的增加，廣藿香植株的株高、葉面積、根系活力和總?cè)~綠素質(zhì)量分數(shù)指標均呈降低的趨勢，推測與土壤酚酸質(zhì)量分數(shù)的增加及微生物區(qū)系的改變有關，相關機制探討仍在進行中。

植物連作障礙不僅會使植株生長受到抑制，還會對其體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶活性產(chǎn)生影響。POD、CAT、SOD是植物體內(nèi)的抗氧化酶，在植物抵御多種外界環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要的作用，具有清除逆境導致的活性氧自由基的作用［17］。MDA是植物細胞膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物的指標，其含量高低表示植物細胞的膜質(zhì)過氧化程度［18］。本研究結(jié)果表明，連栽可能導致廣藿香發(fā)生了氧化脅迫，并致使抗氧化酶活性降低，MDA質(zhì)量摩爾濃度升高。林文雄等［17］也認為藥用植物產(chǎn)生化感物質(zhì)抑制了連作下同類植物體內(nèi)的POD和SOD活性，使得體內(nèi)活性氧累積，導致膜質(zhì)過氧化，細胞膜結(jié)構被破壞。

植物由于雨水淋溶、植株枯葉腐解等產(chǎn)生的化感物質(zhì)進入土壤，對其自身生長、生理生化代謝會產(chǎn)生自毒作用［3-4］，導致植株活性成分的合成及積累受到影響［2］。本研究表明，隨著連栽年限的增加，廣藿香葉綠素質(zhì)量分數(shù)顯著降低，其植株的總揮發(fā)油和百秋李醇質(zhì)量分數(shù)也呈降低趨勢。葉綠素質(zhì)量分數(shù)的降低會對光合作用產(chǎn)生影響，使光合作用的同化產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)降低，進而可能影響其次生產(chǎn)物的積累［4］。本研究為揭示廣藿香連作障礙成因及其作用機制提供了重要依據(jù)，其相關機制仍需深入研究。

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（責任編輯：劉曉涵）

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0315-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041301

收稿日期：2016-04-13

基金項目：廣東省科技計劃項目（2013B020503066）

作者簡介：李龍明（1988—），男，在讀碩士生，從事中藥資源與質(zhì)量研究，Email：965583659@qq.com；通信作者：李明（1963—），女，教授，從事藥用植物資源生態(tài)及質(zhì)量控制，電話：02039352182，Email：13539843803@163.com。

Effect of continuous cropping years on the growth and quality of Pogostemon cablin

LI Longming1，LI Ming1，2，LI Yunqi1，HUANG Jiewen1，Ma Tingyu1，Wu Yanyan1
（1.Guangdong Pharmaceutical University，School of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.State Administration of Traditional Chinese Medicine，Key Laboratory of production and development of medicinal materials from Lingnan，Guangzhou 510006，China）

AbstractObjective To investigate the effect of continuous cropping years on the agronomic characters physiological and biochemical indexes and the contents of the main effective components of P.cablin and provide the basis for revealing the cause of continuous cropping obstacle.Methods The field research method was used to study the planting year continuous cropping for a year and two years of P.cablin in the medicinal botanical garden of Guangdong Pharmaceutical University.Results It showed inhibitory effect on plant height leaf area root activity total chlorophyll content and the activity of POD CAT and SOD in root stem and leaf of P.cablin.The inhibitory intensity increased with continuous cropping years. Furthermore the MDA content of the root stem and leaf on P.cablin were increased and the decreased contents of the total volatile oil and patchouli alcohol were observed.Conclusion Continuous cropping showed inhibitory effect on the growth antioxidant enzyme activity accumulation of the total volatile oil and patchouli alcohol in P.cablin.

Key wordsPogostemon cablin blanco benth. continuous cropping obstacles growth quality