韓　豐　冀子中　金　夏　萬　里　蔡陳效　陳一鵬　陳紅亞　陳敏芳

浙江省嘉興市第一醫(yī)院消化科(314000)

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2009年
—2013年浙江嘉興地區(qū)幽門螺桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥研究*

韓豐#冀子中&金夏萬里蔡陳效陳一鵬陳紅亞陳敏芳

浙江省嘉興市第一醫(yī)院消化科(314000)

背景：幽門螺桿菌(Hp)對(duì)抗菌藥物耐藥是導(dǎo)致根除治療失敗最主要的原因。Hp對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性存在較大地區(qū)差異，了解某一地區(qū)的Hp耐藥情況，對(duì)于提高該地區(qū)Hp根除率具有重要指導(dǎo)作用。目的：了解浙江嘉興地區(qū)臨床分離Hp菌株對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況。方法：納入2009年1月—2013年12月在嘉興市第一醫(yī)院行胃鏡檢查的患者17 402例，取胃竇黏膜標(biāo)本行Hp培養(yǎng)，對(duì)分離培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行甲硝唑、阿莫西林、慶大霉素、呋喃唑酮、克拉霉素和左氧氟沙星藥敏試驗(yàn)。結(jié)果：17 402例胃黏膜標(biāo)本中5 898例(33.9%)Hp培養(yǎng)陽性。藥敏試驗(yàn)顯示各年度、各年齡段甲硝唑單藥耐藥率均極高，克拉霉素、左氧氟沙星耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，呋喃唑酮、阿莫西林、慶大霉素耐藥率均較低?？咕幬锝M合中阿莫西林+慶大霉素組合耐藥率最低，其次為阿莫西林+呋喃唑酮和慶大霉素+呋喃唑酮組合。結(jié)論：浙江嘉興地區(qū)各年齡段臨床分離Hp菌株對(duì)甲硝唑均有極高的耐藥率，不宜作為一線治療選擇。阿莫西林+慶大霉素/呋喃唑酮對(duì)不同年齡段患者均是理想的抗菌藥物組合，對(duì)青霉素過敏者則推薦使用慶大霉素+呋喃唑酮組合。

關(guān)鍵詞幽門螺桿菌；抗菌藥；抗藥性，細(xì)菌；微生物敏感性試驗(yàn)

Resistance ofHelicobacterpylorito Commonly Used Antibiotics in Jiaxing Area, Zhejiang Province from 2009 to 2013HANFeng,JIZizhong,JINXia,WANLi,CAIChenxiao,CHENYipeng,CHENHongya,CHENMinfang.DepartmentofGastroenterology,JiaxingFirstHospital,Jiaxing,ZhejiangProvince(314000)

Correspondence to: JI Zizhong, Email: 13505733400@163.com

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)感染的根除治療一直是消化系疾病研究者最為關(guān)注的問題之一。根除Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍、Hp陽性低級(jí)別胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的有效治療方法，同時(shí)也是降低胃癌發(fā)病率的有效手段[1-3]，世界衛(wèi)生組織(WHO)早已將Hp列為Ⅰ類致癌原。目前我國(guó)臨床根除Hp感染的主流治療方案為鉍劑+質(zhì)子泵抑制劑+2種抗菌藥物，可選用的抗菌藥物包括阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、呋喃唑酮、四環(huán)素等[4]。然而，隨著抗菌藥物的廣泛使用，各類耐藥菌株不斷產(chǎn)生，耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，導(dǎo)致Hp根除率下降[5]。本研究通過分析浙江嘉興地區(qū)臨床分離Hp菌株對(duì)6種常用抗菌藥物的耐藥情況，為該地區(qū)Hp根除治療方案抗菌藥物的合理選擇提供依據(jù)，以期提高該地區(qū)Hp根除率。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

采用連續(xù)抽樣法納入2009年1月—2013年12月因上消化道癥狀在嘉興市第一醫(yī)院就診并行胃鏡檢查的初診患者，取得患者知情同意后送檢Hp培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)。共17 402例患者入選，其中男性8 452例，女性 8 950 例，年齡6～90歲，平均47.84歲；<20歲240例，20～40歲4 523例，40～60歲9 291 例，>60歲3 348例。

二、方法

1. 胃黏膜標(biāo)本采集：胃鏡檢查時(shí)于胃竇小彎側(cè)距幽門5 cm處0.5 cm區(qū)域內(nèi)取胃黏膜標(biāo)本1塊，置于Hp增菌液試管中，旋緊蓋口，于24 h內(nèi)送杭州致遠(yuǎn)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室行Hp培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)。

2. Hp培養(yǎng)和鑒定：Hp培養(yǎng)使用Eppendorf New BrunswickTMGalaxy?170 R-230-0200 CO2培養(yǎng)箱。采用勻漿接種法，將胃黏膜研磨液接種于選擇性培養(yǎng)基[含7%新鮮綿羊血的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基(OXOID公司)]，微需氧環(huán)境(5% O2，10% CO2，85% N2)37 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，菌落經(jīng)鑒定確認(rèn)為Hp菌株后，-70 ℃保存?zhèn)溆?。鑒定標(biāo)準(zhǔn)：光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)小、針尖狀、半透明菌落；革蘭染色陰性；菌體細(xì)長(zhǎng)彎曲呈螺旋形、S形或海鷗狀；尿素酶、過氧化氫酶、過氧化物酶試驗(yàn)陽性；TTC試驗(yàn)斜面培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)金屬光澤。

3. 藥敏試驗(yàn)：采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦的臨界點(diǎn)藥敏試驗(yàn)法，抗菌藥物甲硝唑(M)、阿莫西林(A)、慶大霉素(G)、呋喃唑酮(F)、克拉霉素(C)、左氧氟沙星(L)均為中國(guó)藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品。將抗菌藥物溶液加入含7%新鮮綿羊血的哥倫比亞瓊脂中稀釋至相應(yīng)臨界點(diǎn)耐藥濃度(M 8 μg/mL，A 0.5 μg/mL，G 16 μg/mL，F(xiàn) 2 μg/mL，C 1 μg/mL，L 2 μg/mL)，傾注平板，點(diǎn)種0.5 MCF細(xì)菌懸液10 μL，微需氧環(huán)境37 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，如接種點(diǎn)>1個(gè)菌落，則判定該菌株耐藥。以NCTC11637菌株為質(zhì)控菌株。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、Hp培養(yǎng)結(jié)果

17 402例胃黏膜標(biāo)本中，5 898例Hp培養(yǎng)陽性，陽性率為33.9%。按年度分組分析，Hp培養(yǎng)陽性率分別為2009年28.9%(384/1 327)，2010年28.1%(365/1 297)，2011年30.2%(610/2 018)，2012年33.6%(1 126/3 347)，2013年36.3%(3 413/9 413)。

二、抗菌藥物單藥耐藥情況

各年度臨床分離Hp菌株單藥耐藥率見表1。分析顯示甲硝唑耐藥率2009年為18.5%，2010年—2013年均為100%；克拉霉素、左氧氟沙星耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，2009年分別為8.1%和3.4%，2013年達(dá)到30.9%和32.1%；呋喃唑酮耐藥率各年度均較低，最高僅為2011年的2.1%；阿莫西林、慶大霉素耐藥菌株各年度均≤5株。各年度間甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

各年齡段臨床分離Hp菌株單藥耐藥率見表2。分析顯示甲硝唑耐藥率除<20歲組為 48.6%外，其余年齡段均在90%以上，>60歲組達(dá)到100%；克拉霉素、左氧氟沙星耐藥率在60歲之前處于較低水平，>60歲組達(dá)到100%；呋喃唑酮耐藥率隨年齡增長(zhǎng)而上升，但各年齡段均較低，最高僅為>60歲組的3.7%；阿莫西林、慶大霉素耐藥菌株各年齡段均≤5株。除慶大霉素外，不同年齡段間各抗菌藥物耐藥率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、抗菌藥物組合耐藥情況

各年度臨床分離Hp菌株抗菌藥物組合耐藥率見表3。由于甲硝唑耐藥率在2010年—2013年均為100%，其參與的抗菌藥物組合整體耐藥率與單藥耐藥率無差別，故未納入統(tǒng)計(jì)分析。分析顯示，在阿莫西林參與的組合中，阿莫西林+慶大霉素組合耐藥率最低，其次為阿莫西林+呋喃唑酮組合；而克拉霉素和左氧氟沙星逐年上升的耐藥率明顯影響了這兩種藥物所參與組合的整體耐藥率，使之呈逐年遞增趨勢(shì)(P<0.05)；在非阿莫西林組合中，慶大霉素+呋喃唑酮組合耐藥率最低，整體耐藥率僅高于阿莫西林+慶大霉素和阿莫西林+呋喃唑酮組合。

各年齡段臨床分離Hp菌株抗菌藥物組合耐藥率見表4。分析顯示阿莫西林+慶大霉素組合耐藥率最低，其次為阿莫西林+呋喃唑酮和慶大霉素+呋喃唑酮組合；有甲硝唑參與的組合整體耐藥率均偏高；>60歲組中大部分抗菌藥物組合出現(xiàn)耐藥率為100%的結(jié)果。

表1　各年度臨床分離Hp菌株單藥耐藥率 n(%)

表2　各年齡段臨床分離Hp菌株單藥耐藥率 n(%)

表3　各年度臨床分離Hp菌株抗菌藥物組合耐藥率 n(%)

表4　各年齡段臨床分離Hp菌株抗菌藥物組合耐藥率 n(%)

討論

Hp對(duì)抗菌藥物耐藥是導(dǎo)致根除治療失敗最主要的原因，因此根除治療方案中抗菌藥物的合理選擇應(yīng)受到足夠重視。Hp本身具有高度遺傳多態(tài)性，加之各地區(qū)之間種族、地域、經(jīng)濟(jì)水平、環(huán)境因素以及抗菌藥物使用習(xí)慣的差異[6]，使Hp對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性存在較大地區(qū)差異，造成根除治療方案在全國(guó)范圍內(nèi)難以統(tǒng)一。Hp培養(yǎng)是在適宜Hp生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)從胃黏膜活檢標(biāo)本中分離得到的純Hp活菌，因此不可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。對(duì)臨床分離培養(yǎng)的Hp菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)其結(jié)果指導(dǎo)根除治療方案的制定，可避免使用已產(chǎn)生耐藥的抗菌藥物，降低治療失敗率，提高治療成功率。然而，藥敏試驗(yàn)的標(biāo)本運(yùn)送、培養(yǎng)都需要一定的實(shí)驗(yàn)室條件，且檢測(cè)過程耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)費(fèi)用高，故無法在臨床上大范圍開展。因此，區(qū)域性的Hp耐藥率監(jiān)測(cè)受到研究者的普遍關(guān)注，了解某一地區(qū)的Hp感染情況和菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥情況，制定一個(gè)符合本地區(qū)層面的“個(gè)體化”Hp根除治療方案，對(duì)于提高該地區(qū)Hp根除率具有重要指導(dǎo)作用。

本研究對(duì)浙江嘉興地區(qū)17 402例胃鏡檢查者取胃黏膜標(biāo)本進(jìn)行Hp培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示該地區(qū)臨床分離Hp菌株對(duì)甲硝唑的耐藥率在各年度、各年齡段中均極高，故不宜選用?？死顾啬退幝试谀甓确纸M中呈逐年上升趨勢(shì)，至2013年已達(dá)到30.9%，且>60歲組耐藥率達(dá)100%。2012年歐洲Maastricht Ⅳ共識(shí)指出，克拉霉素高耐藥率(>15%～20%)地區(qū)不宜選用含克拉霉素的Hp根除治療方案[7]，我國(guó)Hp感染處理共識(shí)亦認(rèn)同此觀點(diǎn)[4]，因此建議嘉興地區(qū)60歲以上的老年人行Hp根除治療時(shí)不選用克拉霉素，而其他年齡段可考慮選用。左氧氟沙星是Maastricht Ⅳ共識(shí)中推薦的根除Hp的主要二線治療藥物，在選用時(shí)應(yīng)考慮其在本地區(qū)的耐藥水平。嘉興地區(qū)各年度、各年齡段左氧氟沙星耐藥情況與克拉霉素相似，提示其不宜作為Hp根除治療藥物的一線選擇或應(yīng)先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。該地區(qū)阿莫西林、慶大霉素、呋喃唑酮耐藥率在各年度、各年齡段中均較低，尤其是阿莫西林和慶大霉素，推薦作為Hp根除治療方案中抗菌藥物的優(yōu)選用藥。本研究對(duì)不同抗菌藥物組合耐藥情況的研究顯示，各年度、各年齡段均以阿莫西林+慶大霉素組合耐藥率最低，其次為阿莫西林+呋喃唑酮組合和慶大霉素+呋喃唑酮組合。

Hp菌株對(duì)抗菌藥物耐藥原因眾多，機(jī)制復(fù)雜。甲硝唑耐藥主要是由Hp編碼NADPH硝基還原酶的rdxA基因和編碼NADPH黃素氧化還原酶的frxA基因突變所致，以rdxA基因突變?yōu)橹鱗8]。此外，甲硝唑價(jià)格低廉，在胃內(nèi)具有高穩(wěn)定性和高活性，多年來一直是Hp根除治療方案中的主要抗菌藥物，并被廣泛應(yīng)用于婦科疾病和口腔疾病的治療，這可能是Hp對(duì)甲硝唑耐藥率逐年增高的原因之一?？死顾啬退幹饕c23S rRNA V區(qū)突變有關(guān)[8]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，克拉霉素在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，除Hp根除治療外，在其他感染性疾病中也被廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致Hp對(duì)克拉霉素的耐藥率增高。此外，其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物如紅霉素、阿奇霉素等與克拉霉素存在交叉耐藥，前者的廣泛應(yīng)用也是導(dǎo)致Hp對(duì)克拉霉素耐藥的原因之一。本研究還發(fā)現(xiàn)Hp可對(duì)兩種及以上的抗菌藥物同時(shí)產(chǎn)生耐藥，即多重耐藥。多重耐藥的產(chǎn)生可能與Hp外排泵相關(guān)蛋白過表達(dá)有關(guān)，目前研究證實(shí)外排泵RND家族hefABC基因、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白msbA、spab基因在Hp多重耐藥機(jī)制中起重要作用[9-10]。多重耐藥的產(chǎn)生將使根除Hp變得更加困難，并提示在根除Hp時(shí)應(yīng)選擇正規(guī)治療方案，合理、規(guī)范地使用抗菌藥物，避免單用、亂用、濫用，有條件的地區(qū)最好能在治療前先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，盡可能選用低耐藥率的抗菌藥物組合，以防多重耐藥產(chǎn)生，影響根除治療效果。

綜上所述，浙江嘉興地區(qū)各年齡段臨床分離Hp菌株對(duì)甲硝唑均有極高的耐藥率，不宜作為一線治療選擇；60歲以上的老年人不宜選用克拉霉素；左氧氟沙星耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，作為一線或二線治療藥物亦需慎重考慮；阿莫西林、呋喃唑酮和慶大霉素耐藥率低，阿莫西林+慶大霉素/呋喃唑酮對(duì)不同年齡段患者均是理想的抗菌藥物組合，對(duì)青霉素過敏的患者則推薦使用慶大霉素+呋喃唑酮組合。在慶大霉素的使用過程中，應(yīng)注意對(duì)兒童、老年患者進(jìn)行相關(guān)不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

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(2016-01-03收稿；2016-02-25修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.06.008

*基金項(xiàng)目：浙江省省市共建醫(yī)學(xué)扶植重點(diǎn)學(xué)科計(jì)劃(GJJX010-002)；嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013AY21055)

Background: Resistance ofHelicobacterpylori(Hp) to antibiotics is the primary reason for failure of Hp eradication therapies. It has been reported that there are regional differences in the resistance rate of Hp to commonly used antibiotics. Monitoring the regional Hp resistance status is helpful for improving the eradication rate in local area. Aims: To investigate the resistant spectrum of clinical Hp strains to commonly used antibiotics in Jiaxing Area, Zhejiang Province. Methods: A total of 17 402 patients who underwent gastroscopy from Jan. 2009 to Dec. 2013 at Jiaxing First Hospital were recruited for Hp culturing by using gastric antral biopsies. Then a drug sensitive test was performed for the Hp strains obtained from the culturing. Sensitivity of these Hp strains to metronidazole, amoxicillin, gentamicin, furazolidone, clarithromycin and levofloxacin was determined. Results: Among the 17 402 cases of gastric antral biopsies, 5 898 (33.9%) were positive for Hp culturing. Drug sensitive test revealed that the resistance rate of metronidazole was extremely high in all year and age groups; the resistance rates of clarithromycin and levofloxacin were increasing by years; and the resistance rates of furazolidone, amoxicillin and gentamicin were considerably low in all year and age groups. When two antibiotics were combined, amoxicillin and gentamicin accounted for the lowest resistance rate, and the next were amoxicillin and furazolidone, and gentamicin and furazolidone, respectively. Conclusions: The clinical Hp strains isolated from all age groups in Jiaxing Area, Zhejiang Province are highly resistant to metronidazole, therefore it is not recommended to be used in first line eradication regimen. Amoxicillin combined with gentamicin/furazolidone is an ideal antibiotic combination for patients with Hp infection in all age groups; and combination of gentamicin and furazolidone is recommended to patients who are allergic to penicillin.

Key wordsHelicobacter pylori;Anti-Bacterial Agents;Drug Resistance, Bacterial;Microbial Sensitivity Tests

#Email: atrophygg@hotmail.com

&本文通信作者，Email: 13505733400@163.com