王德君　　閆　軍▲　　高淵濤　　李鵬飛　　王春芳.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原　0000；.南昌大學(xué)瑪麗女王學(xué)院，江西南昌　00；.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，山西太原　0000

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microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷模型對(duì)胃腸動(dòng)力障礙的修復(fù)作用

王德君1閆軍1▲高淵濤2李鵬飛3王春芳3
1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原030001；2.南昌大學(xué)瑪麗女王學(xué)院，江西南昌330031；3.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，山西太原030001

［摘要］目的探討microRNA-31對(duì)脊髓損傷后胃腸動(dòng)力因素的作用。方法將36只microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠和36只FVB小鼠分別設(shè)為對(duì)照組和模型組，用Impactor M-Ⅲ脊髓撞擊器建立小鼠脊髓損傷模型。用BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分評(píng)估小鼠下肢的恢復(fù)情況。HE染色觀察脊髓組織的變化。用Real-time PCR法檢測(cè)生長(zhǎng)抑素受體（SSTR2）mRNA的表達(dá)，用免疫熒光法檢測(cè)一氧化氮合酶（iNOS）蛋白和SSTR2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 造模后第3天、第7天和第14天，脊髓組織破壞、壞死、空泡形成，膠原纖維明顯增加。造模后第14天，F(xiàn)VB模型組與對(duì)照組比較，SSTR2 mRNA的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），iNOS蛋白和SSTR2蛋白的表達(dá)量明顯升高；microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠模型組與對(duì)照組比較，SSTR2 mRNA的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），iNOS蛋白和SSTR2蛋白的表達(dá)量明顯升高；microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠模型組與FVB模型組比較，SSTR2 mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），iNOS蛋白和SSTR2蛋白的表達(dá)量明顯降低。結(jié)論 脊髓損傷后胃腸動(dòng)力障礙的發(fā)生可能與SSTR2 mRNA的表達(dá)上調(diào)、SSTR2蛋白和iNOS蛋白的表達(dá)增高有關(guān)。高表達(dá)的microRNA-31可能與脊髓損傷后胃腸動(dòng)力障礙的恢復(fù)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］脊髓損傷；胃腸動(dòng)力因素；microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠；生長(zhǎng)抑素受體（SSTR2）；一氧化氮合酶（iNOS）

▲通訊作者

外科手術(shù)，尤其是腹部手術(shù)導(dǎo)致的胃腸道結(jié)構(gòu)和功能的改變，對(duì)胃腸動(dòng)力影響很大，術(shù)后常發(fā)生不同程度的胃腸動(dòng)力障礙。胃腸動(dòng)力障礙大多與胃腸功能蠕動(dòng)減弱有關(guān)，而在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)中，胃腸激素是重要介質(zhì)［1］。脊髓損傷后胃腸動(dòng)力障礙與microRNA的調(diào)控作用相關(guān)，microRNA作為具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，在體內(nèi)廣泛參與新陳代謝、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等過(guò)程［2-4］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，microRNA-31對(duì)脊髓損傷有修復(fù)作用［5］，在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷后胃腸動(dòng)力的變化，目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到microRNA-31在脊髓損傷后胃腸動(dòng)力方面的研究，本文通過(guò)研究miRNA-31對(duì)胃腸激素生長(zhǎng)抑素和一氧化氮合酶的影響，探討其對(duì)胃腸動(dòng)力障礙的作用。以期為手術(shù)創(chuàng)傷后microRNA-31對(duì)胃腸動(dòng)力障礙具有調(diào)控作用，為臨床上治療術(shù)后胃腸動(dòng)力障礙提供更好的幫助。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

FVB小鼠（由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），36只，體重25～30 g，雌雄不限，許可證號(hào)為：［SCXK（晉）2015-0001］。microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠（由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），36只，體重25～30 g，雌雄不限，許可證號(hào)［SCXK（晉）2015-0001］。小鼠級(jí)別：清潔級(jí)。

1.2試劑

RNA提取試劑（LifeTechnologies），逆轉(zhuǎn)錄（Takara），熒光定量PCR試劑（Life Technologies），SSTR2兔抗鼠一抗（北京博奧森），iNOS兔抗鼠一抗（北京博奧森），Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗（北京博奧森），引物（Takara），HE染色試劑盒（北京索萊寶），DEPC（Sigma）。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組及處理 各取36只FVB小鼠和36只microRNA-31 FVB小鼠，分為A、B兩組，A組為轉(zhuǎn)基因小鼠，B組為FVB小鼠，每組隨機(jī)抽取21只作為造模組，剩下的作為對(duì)照組。對(duì)A、B兩組需要造模的小鼠用10%的水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻妥后，背部朝上固定小鼠，根據(jù)浮肋連接的是第13胸椎進(jìn)行定位，常規(guī)消毒，用剪刀在小鼠背部正中剪開(kāi)1.5 cm左右的縱向切口，逐層分離直至暴露棘突，再用剪刀小心剔除T10～T13的椎板，暴露脊髓，用Impactor-3撞擊器對(duì)準(zhǔn)T10～T13的中間進(jìn)行垂直打擊，高度為25 cm，重量為5 g。打擊后，小鼠出現(xiàn)尾部痙攣搖擺，雙下肢癱瘓，表明造模成功。

1.3.2小鼠運(yùn)動(dòng)學(xué)評(píng)分分別取造模成功的FVB和miRNA-31FVB小鼠各6只，對(duì)造模前和造模后第1天、第3天、第7天和第14天的FVB和miRNA-31FVB小鼠采用Basso，Beattie&Bresnahan Locomotor rating scale（BBB）［6］運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分法對(duì)其進(jìn)行后肢運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)分。將小鼠放在寬闊平坦的地方活動(dòng)，每日6點(diǎn)左右進(jìn)行雙盲評(píng)分，并記錄評(píng)分結(jié)果。

1.3.3小鼠脊髓HE染色 分別取3只FVB小鼠、3只miRNA-31 FVB小鼠以及造模后第3天、第7天和第14天的FVB和miRNA-31FVB小鼠各3只，解剖小鼠并取下T10～T13節(jié)段脊髓，放入4%的多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)組織脫水、石蠟包埋，7 μm組織切片，HE染色，鏡下觀察。

1.3.4免疫熒光檢測(cè)iNOS和SSTR2蛋白 分別取6只FVB小鼠、6只miRNA-31 FVB小鼠以及造模后第14天的FVB和miRNA-31FVB小鼠各6只。解剖小鼠并取出胃竇及結(jié)腸組織各1 cm，放入4%的多聚甲醛固定24 h。常規(guī)組織脫水、石蠟包埋，7 μm組織切片，組織脫蠟，微波爐熱修復(fù)，7%的山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過(guò)夜，滴加二抗，Hochest復(fù)染，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5RT-qPCR檢測(cè)SSTR2 mRNA分別取6只FVB小鼠、6只miRNA-31 FVB小鼠以及造模后第14天的FVB和miRNA-31FVB小鼠各6只。分別處死，取出結(jié)腸組織，Trizol法提取總RNA，作為模板使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。分別對(duì)目的基因和β-actin進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

SSTR2上游引物5‘TGAGCATCGACCGCTACCT 3‘，下游引物5'CAAAATGACGAGCAGAGACACAC 3‘。β-actin上游引物為5‘CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC 3‘，下游引物為5‘ATGGAGCCACCGATCCACA 3‘。Real-time PCR反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃10 min，95℃15 sec，60℃1 min，循環(huán)40次，95℃15 sec，60℃1 min，95℃15 sec，60℃15 sec。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間計(jì)量資料比較先采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，組間比較采用t檢驗(yàn)。α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

小鼠在術(shù)前的評(píng)分均為21分，無(wú)差異；在7 d和14 d，microRNA-31模型組評(píng)分明顯高于FVB模型組（P＜0.05）。microRNA-31組與FVB組每組各6只小鼠，其中在第1天時(shí)，microRNA-31模型組與FVB模型組比較，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），3 d時(shí)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.81，P＞0.05），7 d時(shí)，microRNA-31模型組與FVB模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.48，P＜0.05），14 d時(shí)，microRNA-31模型組與FVB模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.89，P＜0.05）；microRNA-31模型組，3 d、7 d和14 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=902.6，P＜0.05）；第7天與第3天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 24.0，P＜0.05），第14天與第7天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.80，P＜0.05）；FVB模型組，3 d、7 d和14 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=777.6，P＜0.05），第7天與第3天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.70，P＜0.05），第14天與第7天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.14，P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2脊髓打擊前后組織形態(tài)學(xué)改變

正常組脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，分布均勻，尼氏體清晰，細(xì)胞膜、細(xì)胞核及組織間隙均正常，脊髓損傷后，組織出血、疏松水腫、細(xì)胞空泡變性、部分細(xì)胞細(xì)胞核固縮、神經(jīng)纖維溶解、消失，膠原纖維增多伴淀粉樣變性，灰質(zhì)增生侵入白質(zhì)。見(jiàn)圖1。

2.3免疫熒光檢測(cè)

從免疫熒光檢測(cè)結(jié)果可以看出，正常組胃竇組織iNOS和結(jié)腸組織SSTR2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較少，脊髓損傷后14 d時(shí)，胃竇組織iNOS和結(jié)腸組織SSTR2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，同時(shí)可以看出，microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠與FVB小鼠比較，F(xiàn)VB小鼠的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多。見(jiàn)封三圖1。

2.4RT-qPCR檢測(cè)SSTR2 mRNA

RT-qPCR檢測(cè)SSTR2 mRNA的表達(dá)量，第3組與第1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），脊髓損傷后SSTR2 mRNA的表達(dá)明顯增加；第4組與第2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），脊髓損傷后SSTR2 mRNA的表達(dá)明顯增加；第2組與第1組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩個(gè)對(duì)照組之間無(wú)差異；第3組與第4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠SSTR2 mRNA的增加量明顯低于FVB小鼠。見(jiàn)圖2。

表1　不同時(shí)間點(diǎn)各組BBB評(píng)分比較（±s，分）

表1　不同時(shí)間點(diǎn)各組BBB評(píng)分比較（±s，分）

組別　　樣本數(shù)（只）microRNA-31模型組FVB模型組術(shù)前評(píng)分　術(shù)后評(píng)分1 d　3 d　7 d　14 d 66 21.00±0.00 21.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.52±0.02 0.50±0.02 5.80±0.53 4.10±0.35 10.00±0.30 7.70±0.37

圖1　脊髓T10～T13節(jié)段橫斷面各時(shí)間點(diǎn)擊打處HE染色

3　討論

microRNA具有基因轉(zhuǎn)錄后的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制多種蛋白的表達(dá)，通過(guò)上調(diào)和下調(diào)microRNA的表達(dá)，可以對(duì)胃腸動(dòng)力產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，新近研究發(fā)現(xiàn)，microRNA可以調(diào)控胃腸平滑肌細(xì)胞合成干細(xì)胞因子［7］。有研究［8，9］發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)microRNA的表達(dá)，可以影響腸平滑肌及上皮組織的完整性，表明不同microRNA參與調(diào)控了消化道黏膜上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的增生、分化及成熟。近年研究證明，microRNA在炎癥反應(yīng)時(shí)骨髓肥大細(xì)胞的分化、增殖和功能上起重要作用，調(diào)節(jié)腸易激綜合征的免疫應(yīng)答過(guò)程［10］。目前，microRNA-31對(duì)胃腸動(dòng)力有關(guān)的下游基因的調(diào)控還未見(jiàn)報(bào)道。

小鼠脊髓損傷后，BBB評(píng)分由0分逐漸增大，組織學(xué)觀察損傷初期脊髓組織出現(xiàn)出血、壞死、水腫，符合臨床脊髓損傷的病理變化。說(shuō)明脊髓損傷的模型已成功建立。胃腸運(yùn)動(dòng)信息系統(tǒng)由信號(hào)分子如胃腸肽、信號(hào)接收系統(tǒng)如胃腸肽受體、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)共同組成。信號(hào)分子如有抑制作用的生長(zhǎng)抑素異常，可導(dǎo)致胃腸動(dòng)力障礙［11］。結(jié)腸SSTR2的表達(dá)較高，尤其是肌細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞［12］。一氧化氮合酶是一氧化氮合成過(guò)程中的唯一限速酶，在胃腸道分布廣泛，與消化道的生理調(diào)控和發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切。

有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［13］，脊髓損傷后小鼠組織中的生長(zhǎng)抑素和一氧化氮合酶均增高，它們均可以調(diào)節(jié)脊髓損傷后的胃腸運(yùn)動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組結(jié)腸組織SSTR2 mRNA明顯增高（P＜0.05），胃竇組織iNOS和結(jié)腸組織SSTR2蛋白表達(dá)量明顯增高。由此可見(jiàn)，SSTR2基因表達(dá)異常以及iNOS和SSTR2蛋白表達(dá)異?？赡軈⑴c了脊髓損傷后胃腸動(dòng)力障礙的發(fā)生。microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠模型組與FVB模型組比較，SSTR2 mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），iNOS蛋白和SSTR2蛋白的表達(dá)量明顯降低，由此可以推斷出，高表達(dá)的microRNA-31對(duì)iNOS和SSTR2具有抑制作用，可以促進(jìn)胃腸動(dòng)力障礙的恢復(fù)。

生長(zhǎng)抑素是一種廣泛分布的抑制性腦腸肽，可抑制胃固體排空和胃張力性收縮［14］，另外生長(zhǎng)抑素可參與調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)，其作用機(jī)制包括：①通過(guò)D細(xì)胞旁分泌效應(yīng)直接抑制大多數(shù)肌間叢神經(jīng)元的沖動(dòng)發(fā)放，在神經(jīng)和神經(jīng)元連接處釋放引起腸運(yùn)動(dòng)抑制；②通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌作用直接抑制胃腸道的運(yùn)動(dòng)；③通過(guò)抑制乙酰膽堿作用和抑制胃腸道激素起間接作用［15］。胃腸運(yùn)動(dòng)是受興奮性和抑制性神經(jīng)雙重支配，當(dāng)兩者失衡時(shí)，就會(huì)發(fā)生病理生理紊亂。NO是其中一種重要的抑制性遞質(zhì)，當(dāng)其含量發(fā)生改變時(shí)，就會(huì)打破這種平衡使胃腸動(dòng)力紊亂。NOS作為NO合成的唯一限速酶，在生理狀態(tài)下iNOS分布于胃竇肌層的平滑肌細(xì)胞的胞漿內(nèi)，在病理狀態(tài)下，胃腸內(nèi)的細(xì)胞可由誘導(dǎo)因子作用產(chǎn)生iNOS的表達(dá)。由于NOS與胃腸動(dòng)力障礙的發(fā)生機(jī)理密切相關(guān)，NOS的改變會(huì)影響胃腸的運(yùn)動(dòng)功能，所以選擇了神經(jīng)遞質(zhì)NOS。從結(jié)果中可以推斷出，高表達(dá)量的microRNA-31通過(guò)抑制生長(zhǎng)抑素和一氧化氮合酶的表達(dá)，促進(jìn)了神經(jīng)元對(duì)腸運(yùn)動(dòng)沖動(dòng)的發(fā)放，促進(jìn)了胃張力性收縮，維持了胃腸動(dòng)力的平衡，使胃腸動(dòng)力障礙得到恢復(fù)。

綜上所述，手術(shù)創(chuàng)傷后結(jié)腸組織SSTR2 mRNA的表達(dá)上調(diào)，SSTR2蛋白iNOS蛋白的表達(dá)增高可能參與了胃腸動(dòng)力障礙的發(fā)生，通過(guò)microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠與FVB小鼠的比較，可以推測(cè)出高表達(dá)的microRNA-31參與了脊髓組織損傷后胃腸動(dòng)力障礙的恢復(fù)。為此，我們可以設(shè)計(jì)出microRNA-31芯片或者膠囊，為臨床上治療手術(shù)創(chuàng)傷后胃腸動(dòng)力障礙提供一個(gè)良好的治療方案。

圖2　SSTR2 mRNA的檢測(cè)結(jié)果

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［中圖分類(lèi)號(hào)］R651.2

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1673-9701（2016）13-0031-05

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81371384）；山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目［20（12k01）、2014（k06）、2014（k15）］

收稿日期：（2016-03-15）

Repairing effect of microRNA-31 transgenic mice on gastrointestinal motility disorder in spinal cord injury model

WANG Dejun1YAN Jun1GAO Yuantao2LI Pengfei3WANG Chunfang3
1.Shanxi Medical University First School of Clinical Medicine，Taiyuan030001，China；2.Nanchang University Queen Mary School，Nanchang330031，China；3.Shanxi Medical University Laboratory Animal Center，Taiyuan030001，China

［Abstract］Objective To discuss the effect of microRNA-31 on gastrointestinal motility factors after spinal cord injury. Methods 36 microRNA-31 transgenic mice and 36 FVB mice were divided into control group and model group，respectively.Spinal cord injury model was established by Impactor M-Ⅲ spinal cord striker.The recovery condition of lower limbs in mice was evaluated by BBB locomotion score，and the changes of spinal cord tissues were observed by HE staining.Expression of SSTR2 mRNA was detected by real-time PCR and expressions of iNOS protein and SSTR2 protein were detected by immunofluorescence method.Results At day 3，day 7，and day 14 of modeling，the spinal cord tissues were destroyed and necrotic with vacuolization，and collagenous fiber was markedly increased.At day 14 of modeling，when compared with the control group，the expression of SSTR2 mRNA was significantly higher（P＜0.05），and the expression quantities of iNOS protein and SSTR2 protein were significantly higher in the FVB group（P＜0.05）.In the microRNA-31 transgenic mice model group，when compared with the control group，the expression of SSTR2 mRNA was significantly higher（P＜0.05），and the expression quantities of iNOS protein and SSTR2 protein were significantly higher（P＜0.05）.When compared with the FVB model group，the expression of SSTR2 mRNA was significantly lower（P＜0.05）and the expression quantities of iNOS protein and SSTR2 protein were significantly lower in the microRNA-31 transgenic mice model group.Conclusion Gastrointestinal motility disorder after spinal cord injury is possibly related to up-regulation of SSTR2 mRNA expression and increase of SSTR2 protein and iNOS protein expressions.High-expressive microRNA-31 is possibly related to remission of gastrointestinal motility disorder after spinal cord injury.

［Key words］Spinal cord injury；Gastrointestinal motility factors；MicroRNA-31 transgenic mice；SSTR2；iNOS