張之齡，沈琪琦，朱健，童小文，徐兵，周吳剛

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院急診科，上?！?00011)

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·基礎(chǔ)研究·

血必凈對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織細(xì)胞間粘附分子-1表達(dá)的影響

張之齡，沈琪琦，朱健，童小文，徐兵，周吳剛

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院急診科，上海200011)

目的觀察血必凈對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)大鼠細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達(dá)的影響。方法將45只Wistar 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表分為三組：(1)健康對照(Control)組(15只)、(2)脂多糖 (LPS)組(15只)、(3) 血必凈(XBJ)組 (15只)。LPS組和XBJ組采用股靜脈注射LPS(5 mg/kg)制備大鼠ALI模型。造模前半小時開始給藥，XBJ組給予血必凈4 mL/kg；Control組和LPS組則給予等容積0.9%氯化鈉注射溶液。在造模后6 h、12 h、24 h各隨機(jī)處死大鼠5只，分別作為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞組，光鏡下觀察肺臟組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測肺組織中ICAM-1蛋白表達(dá)。結(jié)果造模后LPS組隨著實(shí)驗(yàn)時間的延長，肺組織ICAM-1蛋白呈逐漸增加趨勢，至24 h達(dá)到高峰。與LPS組相比，血必凈組各時間點(diǎn)肺組織ICAM-1蛋白表達(dá)明顯降低(P

急性肺損傷；膿毒癥；胞間黏附分子1 ；大鼠,Wistar

膿毒癥目前依然是ICU患者最主要的死亡原因，嚴(yán)重時可并發(fā)急性肺損傷(ALI)和多器官衰竭(MOF)。最新的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[1]顯示ALI患者死亡率在34%至58%之間，因此，尋找新的ALI發(fā)病的分子機(jī)制及治療策略刻不容緩。雖然ALI的具體發(fā)病機(jī)制仍不明確，但研究[2]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的黏附功能和炎性反應(yīng)及其相互關(guān)系是導(dǎo)致ALI的主要因素，與炎癥性疾病有著十分密切的關(guān)系，在ALI/ARDS的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。有研究[3-4]認(rèn)為針對ICAM-1進(jìn)行干預(yù)將有利于炎癥的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過觀察血必凈注射液對ALI 模型大鼠肺組織ICAM-1表達(dá)的影響，探討其可能的保護(hù)作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康雄性Wistar大鼠45只，2.5～3.5月齡，體質(zhì)量250～280 g/只，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2008-0016]。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品和試劑血必凈注射液(10 mL/支，天津紅日藥業(yè)有限公司產(chǎn))；脂多糖(LPS,Escherichia coliO127:B8,L3129，Sigma，美國)；ICAM-1羊抗大鼠多克隆抗體(Santa Cruz，美國)。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動物分組、模型建立及給藥方法腹腔注射10%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉后固定，經(jīng)大鼠股靜脈注射LPS(5 mg/kg)。45只SPF級雄性成年Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表分為三組：(1)健康對照組(n=15)、(2)脂多糖組(LPS組，n=15)、(3)血必凈干預(yù)組(XBJ組，n=15)。血必凈組在造模前半小時靜脈內(nèi)給予血必凈4 mL/kg，健康對照組和LPS組則給予等容積0.9%氯化鈉注射溶液。在造模后6 h、12 h、24 h各隨機(jī)處死大鼠5只，分別作為I、Ⅱ、Ⅲ亞組，無菌留取大鼠肺組織。

1.3.2標(biāo)本制備在造模后6 h、12 h、24 h各隨機(jī)處死大鼠5只，分別作為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞組，取右肺上、下葉組織置入4%多聚甲醛固定，制作組織病理切片和免疫組織化學(xué)染色切片用于病理學(xué)檢查。

1.3.3免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測肺組織中ICAM-1蛋白表達(dá)采用SP法檢測肺組織中ICAM-1蛋白表達(dá)。肺組織經(jīng)石蠟包埋作5 μm厚度的切片常規(guī)脫蠟至水，0.3%H2O2甲醇溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶，正常羊血清封閉，滴加一抗(羊抗大鼠ICAM-1多克隆抗體,濃度 1∶50)。PBS漂洗后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精染色。光鏡觀察并應(yīng)用Image pro Plus5.1圖像處理系統(tǒng)采集圖片對結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選5個不重復(fù)的視野，放大400倍，計(jì)算ICAM-1陽性染色的積分吸光度值(IOD)，分別取其平均值進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件包分析，多組均數(shù)采用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化健康對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺泡間隔無炎癥、無水腫。且各時間點(diǎn)無明顯差異；LPS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本毀損，肺泡間隔增寬，部分肺泡內(nèi)見滲出、水腫、出血及纖維蛋白沉積，肺間質(zhì)見大量炎癥細(xì)胞浸潤。且隨時間點(diǎn)增長而明顯。XBJ組大鼠肺組織肺泡隔略有增寬，肺泡內(nèi)滲出、水腫、出血情況有所改善，肺間質(zhì)見少量炎癥細(xì)胞浸潤。

2.2肺組織ICAM-1蛋白的表達(dá)正常大鼠肺組織微弱陽性表達(dá)ICAM-1,僅少量分布于肺泡上皮細(xì)胞。LPS組肺組織ICAM-1強(qiáng)陽性表達(dá)，主要分布于肺泡上皮和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞。XBJ組肺組織ICAM-1陽性表達(dá)減輕。圖像分析軟件測定的積分吸光度值提示，LPS 各亞組較健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，XBJ各亞組較LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　三組大鼠不同時間點(diǎn)肺組織ICAM-1的免疫組織化學(xué)表達(dá)

注：表中為IOD值；與對照組同時間點(diǎn)比較,aP<0.05；與LPS組同時間點(diǎn)比較,bP<0.05

3　討論

膿毒癥常在感染和手術(shù)應(yīng)激情況下發(fā)生，其本質(zhì)為大量細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)釋放后引起宿主自身免疫損傷進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征。流行病學(xué)調(diào)查顯示，膿毒癥與諸多免疫信號通路異常激活有密切的關(guān)系。有研究證實(shí)，臨床上超過60%膿毒癥患者的致病菌為革蘭陰性菌[5]，而啟動免疫反應(yīng)的LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁釋放的重要成分。LPS與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，激活了一系列免疫信號通路，同時分泌大量炎性因子，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生失控的炎性反應(yīng)[6]。目前，膿毒癥確切的分子發(fā)病機(jī)制還不清楚。

ALI是膿毒癥最主要的器官并發(fā)癥[7]。由于膿毒癥引起機(jī)體免疫功能受損，致使大量處于極度活躍狀態(tài)的炎癥細(xì)胞諸如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子進(jìn)一步加重肺組織及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷。因此，深入研究膿毒癥誘導(dǎo)肺損傷的發(fā)病機(jī)制對于臨床治療ALI至關(guān)重要。

ICAM-1又名 CD54,是免疫球蛋白超家族類的成員之一，是一種重要的細(xì)胞表面粘附分子[8]，其參與介導(dǎo)中性粒細(xì)胞與上皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，在炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中具有不可替代的作用。作為粘附分子家族的重要成員之一，ICAM-1在重癥急性胰腺炎早期即顯著升高，并與急性肺損傷的發(fā)生有密切的關(guān)系，提示 ICAM-1可能在危重病時介導(dǎo)了炎癥網(wǎng)絡(luò)的形成。在各種ALI/ARDS動物模型中發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面大量并持久表達(dá)，并且ICAM-1的表達(dá)量與肺損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[9-10]。有研究表明，經(jīng) ICAM-1基因敲除處理后的小鼠，可阻斷PMN與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，進(jìn)而減輕肺組織的損傷；應(yīng)用 ICAM-1單克隆抗體阻斷ICAM-1形成，可減輕LPS引起的肺、腎、肝等多器官損傷[11]。全身的炎性反應(yīng)及致病因子對肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷是ALI的發(fā)病機(jī)制中最主要的環(huán)節(jié)。中性粒細(xì)胞(PMN)、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥介質(zhì)以及它們與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用[12-13]貫穿了全身炎性反應(yīng)的整個過程，而ICAM-1 在細(xì)胞與細(xì)胞粘附的相互作用過程中起重要作用。如能有效地控制ICAM-1的過度表達(dá)，對ALI的治療具有重要意義。

血必凈是由中藥赤芍、川芎、丹參、紅花、當(dāng)歸的提取物組成的復(fù)方中藥靜脈制劑，具有很好活血化瘀、疏通絡(luò)脈、潰散毒邪的作用。臨床上被廣泛應(yīng)用于治療膿毒癥。多項(xiàng)研究證實(shí)血必凈是一種有效的抗炎藥物，能增強(qiáng)annexin A1表達(dá)并抑制白介素(IL)-1，6，8，23和TNF-α等促炎因子的生成[14-16]。王煜霞等[17]發(fā)現(xiàn)血必凈能顯著抑制缺血再灌注家兔肺組織ICAM-1釋放,提高家兔的動脈氧分壓。顧滔[18]在對復(fù)蘇綜合征患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)血必凈可有效下調(diào)ICAM-1等炎癥介質(zhì)的過量表達(dá)，從而抑制機(jī)體過度炎性反應(yīng)，提高患者的30 d存活率。

本實(shí)驗(yàn)采取LPS靜脈內(nèi)注射的方式造模。本實(shí)驗(yàn)病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肺泡間隔增寬，肺泡腔出血，間質(zhì)內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤，提示成功建立了ALI的動物模型。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法檢測的研究結(jié)果顯示，同時間點(diǎn)LPS組的肺組織ICAM-1蛋白表達(dá)量顯著高于正常組，且呈逐漸上升趨勢，結(jié)合對膿毒癥大鼠的肺組織病理學(xué)觀察等結(jié)果，發(fā)現(xiàn) ICAM-1蛋白表達(dá)水平與肺組織的病理損害程度基本一致。提示ICAM-1 可能在脂多糖誘導(dǎo)ALI的過程中具有重要作用,與 Beck-Schimmer等[19]的結(jié)果相吻合。

本實(shí)驗(yàn)前期研究[20-21]發(fā)現(xiàn)，血必凈可以有效減輕ALI 時肺組織的炎性反應(yīng)。為了進(jìn)一步研究血必凈對ALI大鼠的保護(hù)作用機(jī)制，本研究擬從分子機(jī)制上探討其對肺組織局部ICAM-1表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，血必凈可通過抑制ICAM-1的表達(dá),進(jìn)而減少炎性因子的釋放和炎性反應(yīng)的擴(kuò)大，減輕肺組織炎性反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對膿毒癥誘導(dǎo)肺損傷的保護(hù)作用，為臨床救治急性肺損傷提供了新思路。

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Effect of Xuebijing on expression of ICAM-1 in the lung tissue of rats with acute lung injury induced by lipopolysaccharide

ZhangZhiling，ShenQiqi，ZhuJian，TongXiaowen，XuBing，ZhouWugang

(DepartmentofEmergentMedicine,AffiliatedNinthPeople'sHospital，SchoolofMedicine，ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200011，China)Correspondingauthor:ShenQiqi，Email：shen＿qiqi@21cn.com

ObjectiveTo observe the effect of Xuebijingon expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)in the lung tissue of rats with acute lung injuryinduced by lipopolysaccharide.MethodsForty-five Wistar rats were randomly divided into 3 groups byrandom number table method：(1)control group(n=15)，(2)LPS group(n=15)，(3) Xuebijing group(XBJ group) (n=15).Injection of LPS(5 mg/kg) into femoral vein to reproduce ALI model in LPS group and XBJ group.Male Wistar rats of XBJ group were given XBJ 4 mL/kg 30 min before the intravenous injection of LPS,whereas control group and LPS group were given equivalent volume normal saline.Five rats in each group were killed at 6 h,12 h and 24 h，which were divided into subgroup I,Ⅱ,Ⅲ.The pathomorphism changes of lung tissue were observed by light microscope，and expression of ICAM-1 in pulmonary was examined by immunohistochemistry.ResultsExpression of ICAM-1 were gradually increased with experimental time prolonged and reached the peak at 24h in LPS group after establishing model.ICAM-1 were significantly lower in XBJ group than LPS group at each time points (P<0.05).Compared to LPS group,the pathological change was significantly reduce in XBJ group under microscope.ConclusionXuebijing can inhibit the expressions of ICAM-1 and reduce acute lung injury induced by lipopolysaccharide in the lung tissue of rats.

Acute Lung injury；Sepsis；Intercellular adhesion molecule-1 ；Rats,Wistar

張之齡，副主任醫(yī)師，Email：zhangzhiling1970@163.com

沈琪琦，副主任醫(yī)師，Email：shen＿qiqi@21cn.com

R563.8

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.04.022

2016-02-16)