陳猶白　陳聰慧　QiXH zhang　韓巖

[摘要]創(chuàng)傷或腫瘤導(dǎo)致的軟組織缺損是整形科的常見問題，現(xiàn)有的組織瓣移植、人工材料充填或脂肪移植等方法均有一定局限性。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem eells，ASCs）是來自脂肪組織的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，基于ASCs的干細(xì)胞治療，或利用其成脂分化能力構(gòu)建組織工程脂肪，為軟組織缺損的修復(fù)重建提供了新的思路，在整形美容和再生醫(yī)學(xué)中展示了良好的前景。體外利用藥物和化學(xué)試劑誘導(dǎo)ASCs成脂分化的方法已經(jīng)非常成熟。支架材料通過模擬干細(xì)胞的體內(nèi)微環(huán)境，可促進(jìn)ASCs的黏附、增殖和成脂分化，其中脫細(xì)胞脂肪組織支架是目前脂肪組織工程支架材料的研究熱點(diǎn)。研究顯示ASCs的供體種屬、性別、年齡、脂肪獲取部位和方法等供體因素，細(xì)胞亞群、ASCs代數(shù)、培養(yǎng)液、凍存等實驗因素，表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、骨形成蛋白、尼爾樣1型分子等生長因子，胰島素、糖皮質(zhì)激素、雌激素、生長激素、瘦素、催產(chǎn)素和卡貝縮宮素等激素，異丁基甲基黃嘌呤、紫杉醇、胰高血糖素樣肽等化學(xué)藥物，放射線和激光等物理因素，以及To11樣受體、富血小板血漿和富血小板纖維蛋白、人腺病毒36亞型、核心結(jié)合因子α1等其他因素均可影響ASCs的成脂分化。因此綜合利用各種上述因素，促進(jìn)ASCs的增殖和定向分化，在整形美容和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的意義和應(yīng)用前景。本文總結(jié)了誘導(dǎo)和驗證ASCs成脂分化的方法，討論了主要影響因素及其機(jī)制，介紹了解放軍總醫(yī)院整形修復(fù)科和美國MD安德森腫瘤中心整形科組織再生和分子細(xì)胞工程實驗室（Tis sue Regeneration andMolecular Cell Engineering Lab，TRAMCEL）的相關(guān)經(jīng)驗，展望了未來研究方向。

[關(guān)鍵詞]脂肪干細(xì)胞；分化；成脂分化；影響因素；機(jī)制

[中圖分類號]R622 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）04-0086-08

創(chuàng)傷和腫瘤導(dǎo)致的軟組織缺損是整形修復(fù)科的常見問題，嚴(yán)重影響患者的外形和功能。以乳腺癌術(shù)后的乳房缺損為例，在解放軍總醫(yī)院整形修復(fù)科約占患者量的7%，而在美國MD安德森腫瘤中心（MD Anderson Cancer Center，MDACC）整形科占患者量高達(dá)55%。常規(guī)的治療方法是組織瓣移植、人工材料充填或脂肪移植等，但均有一定局限性。腹部肌皮瓣游離移植是重建乳房的重要手段，盡管移植后壞死等并發(fā)癥的發(fā)生率越來越低，但是不可避免供區(qū)損傷。隨著材料工業(yè)的發(fā)展，硅膠假體植入逐漸成為了隆胸和乳房重建的重要手段，其動態(tài)外形和手感越來越接近真實組織，但是仍存在異物反應(yīng)和纖維囊包膜攣縮的風(fēng)險。更重要的是，截止至2015年11月，MDACC整形科共發(fā)現(xiàn)了87例由于乳房假體植入導(dǎo)致的問變性大細(xì)胞淋巴瘤，其中位存活期為13年，5年存活率89%。盡管其發(fā)病率非常低，約百萬分之一至三，且通過外科切除可有效治療，但仍然為乳房假體植入的患者增添了一絲隱患。應(yīng)用自體脂肪移植充填軟組織凹陷是整形美容外科的常用方法，但是用于重建乳房等較大缺損時易因缺血而吸收，吸收率高且無法預(yù)測，常需要二次手術(shù)。

組織工程和再生醫(yī)學(xué)為修復(fù)或替換受損組織提供了新的途徑，而種子細(xì)胞是其中的關(guān)鍵。脂肪干細(xì)胞（adipose derived stem cell，ASCs）的來源充足、獲取簡便、產(chǎn)量高、增殖快，具有多向分化潛能，可旁分泌各種細(xì)胞因子，促進(jìn)血管形成，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，并能招募其他細(xì)胞參與重建，因此一直是種子細(xì)胞的熱門人選。Zuk等最早驗證了ASCs具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肌細(xì)胞分化的多向分化潛能。除了上述細(xì)胞外，研究證實ASCs在特定的誘導(dǎo)條件下可向平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胰島細(xì)胞、表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)耳毛細(xì)胞、角膜細(xì)胞、造血細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞等內(nèi)、中、外三胚層的多種細(xì)胞分化（圖1）。基于ASCs的干細(xì)胞療法，或利用ASCs的成脂分化能力構(gòu)建組織工程脂肪，逐漸成為再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)，但是目前缺乏對于ASCs成脂分化的系統(tǒng)綜述。本文總結(jié)了誘導(dǎo)和驗證ASCs成脂分化的方法，討論了主要影響因素及其機(jī)制，介紹了解放軍總醫(yī)院整形修復(fù)科和MDACC整形科組織再生和分子細(xì)胞工程實驗室的相關(guān)經(jīng)驗，并展望了未來研究方向。

1數(shù)據(jù)來源

于2016年2月20日在PubMed中以“（（（adipose stem cell[Title]）OR adipose derived stem cell[Title]）OR adipose-derived mesenchymal stem cell[Title]）AND differentiation[Title]”作為檢索式檢索，共有文獻(xiàn)35篇，其中近5年文獻(xiàn)30篇。在SinoMed中以“（”脂肪干細(xì)胞“[中文標(biāo)題：智能]）AND“分化”[中文標(biāo)題：智能]”作為檢索式檢索，共有文獻(xiàn)176篇，其中綜述13篇，近5年文獻(xiàn)104篇。通過標(biāo)題及摘要選取與ASCs的成脂分化相關(guān)的文獻(xiàn)，并閱讀其參考文獻(xiàn)的標(biāo)題和摘要，從中再次選取與ASCs成脂分化的誘導(dǎo)和鑒定方法、影響因素等相關(guān)的文獻(xiàn)，剔除重復(fù)文獻(xiàn)，最終納入代表性文獻(xiàn)共50篇。于2016年4月8日在www.clinicaltrial.gov上以“adipose stem cell”搜索，結(jié)果顯示有194項臨床試驗，用“adipose-derived stemcells”搜索有126項臨床試驗，閱讀試驗標(biāo)題與擬治疾病，選取與ASCs成脂分化相關(guān)的臨床試驗12項。

2誘導(dǎo)ASCs分化成脂的方法

2.1化學(xué)誘導(dǎo)法

Zuk等最早使用含有10%的胎牛血清、1μmol/l地塞米松、0.5mmol/l異丁基甲基黃嘌呤（IMBX）、10μmol/1胰島素、200μmol/1吲哚美辛的分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)ASCs成脂分化。地塞米松通過解離與胞質(zhì)內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合的熱休克蛋白90，增加糖皮質(zhì)激素受體數(shù)目，激活其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs），促進(jìn)成脂分化。地塞米松還可激活甲狀旁腺激素信號通路，放大細(xì)胞對骨形態(tài)蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）的反應(yīng)，上調(diào)成脂分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）的表達(dá)，促進(jìn)ASCs的成脂分化。地塞米松還能直接抑制Runx2等成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，使ASCs成脂分化。但是有研究顯示地塞米松等糖皮質(zhì)激素可能在分化早期抑制ASCs的增殖，其機(jī)制是與B catenin結(jié)合，減少β-catenin的核內(nèi)蓄積，抑制細(xì)胞周期蛋白D3、細(xì)胞周期素依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）等，促進(jìn)CDKs抑制因子P27和P21的表達(dá)，抑制DNA的復(fù)制。地塞米松還能激活MKP-1，使細(xì)胞外信號調(diào)控激酶去磷酸化，抑制ASCs的增殖。此外，地塞米松可抑制包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）、白介素-6、尿激酶型纖溶酶原激活物受體、單核細(xì)胞化學(xué)趨化蛋白1、金屬基質(zhì)蛋白酶1等促血管形成蛋白的表達(dá)，從而抑制ASCs誘導(dǎo)的血管新生。因此決定地塞米松的濃度，以達(dá)到ASCs增殖和分化的平衡，并降低其對血管新生的抑制作用非常重要。IBMX是磷酸二酯酶的特異性抑制劑，可提高胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的水平，進(jìn)而激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，調(diào)控C/EBPs的表達(dá)，促進(jìn)ASCs成脂分化。胰島素與受體結(jié)合后，通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路降低核蛋白磷酸酶的活性，激活CREB的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增加PPAR丫和c/EBP α的表達(dá)，增強(qiáng)脂肪形成基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)低度分化的脂肪前體細(xì)胞成熟。此外，胰島素還能通過激活磷酸肌醇3激酶信號通路，促進(jìn)ASCs成脂分化。在成脂分化早期胰島素主要通過胰島素樣生長因子-1受體發(fā)揮作用，隨著分化的進(jìn)行轉(zhuǎn)而通過胰島素受體發(fā)揮作用。

不同實驗小組使用的成脂誘導(dǎo)液成分幾乎相同，但濃度有一定差異。有學(xué)者分別在Zuk誘導(dǎo)液的基礎(chǔ)上添加了問充質(zhì)細(xì)胞生長添加物、L-谷氨酰胺、三碘甲狀腺氨酸、生物素和泛酸鹽等成分，發(fā)現(xiàn)也可誘導(dǎo)ASCs的成脂分化。不同濃度的成分可能影響誘導(dǎo)效率，但目前尚未達(dá)成一致。有學(xué)者認(rèn)為高濃度的地塞米松、胰島素和IBMX可以促進(jìn)ASCs成脂分化，而另外一些學(xué)者認(rèn)為降低地塞米松、胰島素和吲哚美辛的濃度，并不影響ASCs的成脂分化。有研究顯示大劑量的胰島素并不影響細(xì)胞數(shù)量，而是增加了脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)含量。目前有多種商業(yè)化的成脂分化誘導(dǎo)液，避免了因每次配制誘導(dǎo)液的差異導(dǎo)致實驗結(jié)果的變異。本實驗室體外化學(xué)誘導(dǎo)ASCs成脂分化的步驟如下：將第2代的ASCs用PBS漂洗后，用胰蛋白酶+EDTA處理，將細(xì)胞懸液1000rpm離心5min后去上清，重懸后細(xì)胞計數(shù)，以5×10³個細(xì)胞/cm²的密度種植于12孔板，24h后更換為成脂分化誘導(dǎo)液（StemPro Adipogenesis DifferentiationKit，Gibco，USA）繼續(xù)培養(yǎng)，每3d換液，培養(yǎng)2～3周后油紅0染色驗證其分化結(jié)果。

2.2生物誘導(dǎo)法

2.2.1細(xì)胞共培養(yǎng)：在體內(nèi)，ASCs的周圍細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)可通過釋放各種生長因子等信號，調(diào)控ASCs分化。體外研究發(fā)現(xiàn)，將ASCs與成熟的脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)，或利用脂肪組織的分泌物或條件培養(yǎng)基等，也可促進(jìn)ASCs的成脂分化，其機(jī)制可能與其中含有的各種生長因子有關(guān)。

2.2.2支架誘導(dǎo)：支架是組織工程的三要素之一，常見的脂肪組織工程支架材料包括膠原、明膠、透明質(zhì)酸及其衍生物、基底膠、纖維蛋白、殼聚糖、硫酸軟骨素等天然細(xì)胞外基質(zhì)，聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）、甲基丙烯酸酯、聚乙烯乙二醇丙烯酸酯（PEDGA）等可降解人工高分子聚合物。每種材料都各有優(yōu)劣，研究證實通過結(jié)合不同的材料或?qū)Σ牧媳砻孢M(jìn)行修飾和改造，可以促進(jìn)ASCs的黏附、增殖和分化。

近來的研究顯示脫細(xì)胞脂肪組織可以促進(jìn)ASCs成脂分化。Flynn等將人ASCs種植于有完整基底膜的脫細(xì)胞脂肪支架中，發(fā)現(xiàn)ASCs在沒有外源激素和生長因子的情況下向脂肪細(xì)胞分化并表達(dá)脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、PPAR和c/EBPs。他們認(rèn)為脂肪組織工程的重點(diǎn)在于其支架的選擇、復(fù)合物的構(gòu)建和運(yùn)載方式上，更傾向于應(yīng)用水凝膠形式的復(fù)合物，以微創(chuàng)注射的方式實現(xiàn)軟組織的充填和重建。他們將光交聯(lián)的乙二醇甲基丙烯酸酯殼聚糖和硫酸軟骨素組成運(yùn)載工具，結(jié)合脫細(xì)胞支架構(gòu)成水凝膠，ASCs種植后體外培養(yǎng)14d發(fā)現(xiàn)磷酸甘油脫氫酶活性和成脂相關(guān)基因表達(dá)顯著增高，同時可見細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，證實上述復(fù)合物促進(jìn)了ASCs的成脂分化。體內(nèi)實驗顯示甲基丙烯酸酯乙二醇?xì)ぞ厶?ASCs復(fù)合物顯著促進(jìn)細(xì)胞浸潤、血管生成和脂肪形成。本實驗室重復(fù)了Flynn研究小組的實驗，獲得了相同的結(jié)果。我們還將脫細(xì)胞組織的研究拓展至肌肉、筋膜、氣管等（圖2），其結(jié)果顯示脫細(xì)胞組織支架可以有效的誘導(dǎo)ASCs的定向分化，我們推測脫細(xì)胞組織支架可以提供適宜ASCs增殖和分化的三維結(jié)構(gòu)，釋放組織特異性的分化信號，最大程度的還原了體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)等微環(huán)境，誘導(dǎo)ASCs向特定的細(xì)胞或組織分化。

3驗證ASCs分化成脂的方法

3.1染色

驗證ASCs分化成脂的最簡單的方法是油紅0染色。油紅0是一種易溶于苯、乙醇和丙酮，不溶于水的脂溶性物質(zhì)，可以將脂滴特異性的染成紅色。本實驗室的配置油20的方法如下：將250mg的油紅粉末放入50ml的異丙醇中配成油紅原液，取3份油紅原液加入2份PBS，靜置10min后使用。油20染色步驟如下：PBS漂洗3次，每次5min，蒸餾水漂洗2次，用4%的多聚甲醛4℃下固定10min。蒸餾水漂洗2次，每次5min，取lml的配好的0.5%油210室溫下染色30min，用60%的異丙醇漂洗，去離子水徹底清洗3次，每次5min，顯微鏡下觀察并拍照。實驗中發(fā)現(xiàn)油紅粉末溶解不完全時，可能存在一些肉眼無法發(fā)現(xiàn)的黑色雜質(zhì)，染色后用PBS難以洗掉，因此油210一定要現(xiàn)用現(xiàn)配，配置時搖勻使粉末盡量溶解，使用前用0.2 μm的濾網(wǎng)過濾。

3.2相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)

檢測PPARγ、LPL、脂肪酸結(jié)合蛋白4、激活蛋白2、瘦素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4等成脂相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)是驗證ASCs成脂分化的有效手段。其中PPARγ2和脂肪酸結(jié)合蛋白4在未分化的ASCs中也有微弱的表達(dá)，PPARγ2在誘導(dǎo)1周后可見表達(dá)明顯升高，而脂肪酸結(jié)合蛋白4在誘導(dǎo)2周后有強(qiáng)烈表達(dá)（圖3）。

3.3其他驗證方法

Pierre等將ASCs培養(yǎng)在多電極陣列上并誘導(dǎo)其成脂和成骨分化，12h后測量底物阻抗，發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)的隔離電阻上升至1.7 ohm·cm²，而成脂誘導(dǎo)為0.63 ohm·cm²。誘導(dǎo)4d后，成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞膜電容顯著高于成骨誘導(dǎo)的ASCs。通過長時間的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)成脂和成骨誘導(dǎo)的ASCs有著截然不同的介電性能。這一方法利用ASCs分化中的細(xì)胞底物的電阻抗傳感差異，實時監(jiān)測ASCs的分化，從學(xué)科交叉的角度為ASCs的分化驗證提供了新的思路。

4影響ASCs分化成脂的因素及機(jī)制

4.1供體因素

4.1.1種屬：除人類之外，鼠、兔、豬、馬、羊等不同種動物的ASCs均可分化為脂肪細(xì)胞，但是其分化能力不盡相同，有研究顯示小鼠ASCs的分化成脂能力高于人ASCs，迄今為止的大多數(shù)研究局限于上述2～3種動物的ASCs的生物學(xué)特性，缺乏橫向的對比和總結(jié)。

4.1.2性別：Ogawa等認(rèn)為由于雌激素的促進(jìn)脂肪形成作用，雌性小鼠的ASCs的分化成脂能力優(yōu)于雄性。

4.1_3年齡：有研究顯示隨著年齡增長，ASCs的成脂能力逐漸下降，但是zhu等認(rèn)為年齡對ASCs的成脂能力無影響。

4.1.4脂肪獲取部位：不同部位來源的ASCs的成脂分化能力可能有一定差別，但是哪個部位的ASCs的成脂分化能力更強(qiáng)尚無定論。Schipper等認(rèn)為腹部皮下脂肪來源的ASCs分化成脂能力優(yōu)于內(nèi)臟脂肪或大腿脂肪來源的ASCs。但是Cawthorn等則認(rèn)為內(nèi)臟脂肪來源的ASCs的成脂能力強(qiáng)于皮下脂肪來源的ASCs。

4.1.5脂肪獲取方法：吸脂術(shù)操作簡單、創(chuàng)傷小，是目前獲取脂肪的主要方法，有學(xué)者認(rèn)為吸脂術(shù)獲得的脂肪比外科切除法有更好的成脂分化能力，但是我們的研究發(fā)現(xiàn)脂肪獲取方法并不影響ASCs的分化能力。吸脂術(shù)的腫脹麻醉液可能影響ASCs的生物學(xué)特性，有學(xué)者認(rèn)為以利多卡因、羅哌卡因或布比卡因為主要成分的麻醉腫脹液對hASCs具有一定毒性，抑制hASCs增殖但不影響其成脂分化能力。因此大多數(shù)學(xué)者主張在獲取脂肪后用無菌鹽水或平衡液清洗，但是Gino等則認(rèn)為無需清洗直接進(jìn)行脂肪移植或分離ASCs，并不影響其效果。

4.2實驗因素

4.2.1細(xì)胞亞群：有研究顯示CD34-亞群比CD34+的ASCs成脂能力更強(qiáng)，可能因為CD34是維持干性的標(biāo)記物，當(dāng)CD34的表達(dá)變?yōu)殛幮詴r，意味著ASCs的多向分化潛能降低，但是向某一特定類型細(xì)胞分化的能力增強(qiáng)。

4.2.2 ASCs的培養(yǎng)代數(shù)：10代以前的ASCs成脂成骨分化能力接近，而10代以后的ASCs趨于向成骨細(xì)胞分化，成脂能力逐漸降低。Guilak等誘導(dǎo)第4代的ASCs其向脂肪、骨、軟骨和神經(jīng)細(xì)胞方向分化，結(jié)果顯示81%的ASCs可以分化為其中一種細(xì)胞，52%可分化為兩種或兩種以上的細(xì)胞，分化為脂肪、骨、軟骨和神經(jīng)樣細(xì)胞的比率分別為52%、48%、43%和12%，證明第4代時ASCs的成脂和成骨能力接近。Rodriguez等的研究顯示體外培養(yǎng)160代的ASCs仍然具有成脂分化的潛能，文獻(xiàn)中一般使用3～5代的ASCs進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)，過低代數(shù)的ASCs可能增加異種細(xì)胞污染的風(fēng)險，而過高則可能降低了其成脂分化能力。

4.2.3培養(yǎng)液血清濃度：培養(yǎng)液血清濃度XCASCs的成脂分化的影響尚無定論，有學(xué)者認(rèn)為培養(yǎng)液中高濃度的血清通過增加PPAR γ的表達(dá)從而促進(jìn)ASCs的成脂分化，也有學(xué)者認(rèn)為高濃度的血清中過高濃度的生長因子可能降低ASCs的分化能力，而無血清的培養(yǎng)液對ASCs的成脂分化沒有影響。有研究顯示含2%血清的MesenPRO RS培養(yǎng)液比普通培養(yǎng)液更適合用于成脂分化誘導(dǎo)。

4.2.4凍存：ASCs可以耐受長期的低溫凍存，復(fù)蘇后存活率高，對增殖和分化能力無明顯影響。

4.3生長因子

4.3.1表皮細(xì)胞生長因子（epithelial growth factor，EGF）：EGF通過在mRNA水平增加C/EBPα、PPARγ，和PPARγ共激活因子1的編碼以及其下游目標(biāo)蛋白AP2和LPL的表達(dá)，促進(jìn)ASCs的成脂分化。

4.3.2成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）：FGF通過促進(jìn)ASCs的增殖，提高其成脂分化能力。研究顯示經(jīng)FGF預(yù)處理的ASCs誘導(dǎo)成脂分化后1hPPARγ的表達(dá)增加，5d時達(dá)到高峰。有學(xué)者將ASCs與FGF10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了ASCs的成脂分化。重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（rh-bFGF）對ASCs成脂分化的促進(jìn)作用與其濃度呈正相關(guān)，40ng/ml的rh-bFGF為最佳濃度。FGF和EGF有協(xié)同作用。

4.3.3血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）：VEGF作為內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原和血管通透性的調(diào)節(jié)因子，通過與酪氨酸受體結(jié)合，刺激血管新生。有學(xué)者認(rèn)為VEGF可以促進(jìn)ASCs向脂肪細(xì)胞分化，但也有研究顯示VEGF對ASCs的分化沒有影響。

4.3.4胰島素樣生長因子1（insuli-like growth factor 1，IGF-1）：IGF-1促進(jìn)成脂分化的機(jī)制與胰島素相同，此處不再贅述。有研究顯示IGF-1在大鼠腸系膜基質(zhì)血管細(xì)胞中可以增加C/EBPα和FABP2 mRNA的表達(dá)。由于IGF-1與胰島素通過同一通路促進(jìn)向脂肪細(xì)胞方向的分化，因此在體外誘導(dǎo)中IGF-1可替代胰島素的作用。

4.3.5骨形成蛋白（Bone morphogenic proteins，BMPs）：BMPs參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡，在胚胎細(xì)胞的發(fā)育中期重要作用。BMPs共有20多種，其中BMP-4能夠通過上調(diào)PPARγ，基因的表達(dá)誘導(dǎo)ASCs的成脂分化。

4.3.6尼爾樣1型分子（Nel-like type 1 molecule，Nell-1）：Nell-1是與人顱縫早閉相關(guān)的外泌型蛋白，是一種新的生長因子，Nell-1可抑制ASCs的成脂分化，使其保持高效的成骨作用。

4.3.7轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）：有研究顯示TGF對ASCs成脂分化的影響具有濃度依賴的雙向作用，即低濃度時抑制成脂分化，高濃度時促進(jìn)成脂分化。

4.3.8其他：有研究顯示血小板源性生長因子、肝細(xì)胞生長因子、白介素17等也可以促進(jìn)ASCs的成脂分化。

4.4激素

與生長因子一樣，激素對于干細(xì)胞的調(diào)控也是一個復(fù)雜的立體網(wǎng)絡(luò)，激素可直接與干細(xì)胞相應(yīng)的激素受體結(jié)合，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控其分化，或間接改變干細(xì)胞的周圍環(huán)境，通過細(xì)胞間作用或旁分泌作用調(diào)控其分化。

4.4.1胰島素：胰島素是成脂分化誘導(dǎo)液中的的主要成分之一，其促進(jìn)ASCs的成脂分化的機(jī)制前文已經(jīng)介紹，此處不再贅述。

4.4.2糖皮質(zhì)激素：以地塞米松為主的糖皮質(zhì)激素是ASCs成脂分化誘導(dǎo)液的主要成分之一，其促進(jìn)ASCs成脂分化的機(jī)制前文已經(jīng)介紹，此處不再贅述。值得注意的是，糖皮質(zhì)激素激動劑也可促進(jìn)ASCs成脂分化。

4.4.3雌激素：雌激素可以提高脂質(zhì)儲積量和脂肪細(xì)胞量，且具有劑量依賴性，即雌激素水平越高，ASCs的成脂分化能力越強(qiáng)。

4.4.4生長激素：生長激素具有促進(jìn)多種細(xì)胞分化的作用，動物實驗顯示生長激素可以促進(jìn)脂肪生成。生長激素通過提高C/EBP B、C/EBP 6和PPARγ的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)脂肪分化。生長激素和胰島素有共同的下游因子，因此在體外實驗中生長激素可以發(fā)揮胰島素樣作用。但也有學(xué)者指出，生長激素在脂肪分化早期有抑制分化的作用。生長激素對脂肪分化的影響還有部位特異性，生長激素基因敲除小鼠內(nèi)臟脂肪細(xì)胞分化減弱，而皮下脂肪則不受影響。

4.4.5瘦素：瘦素可以抑制ASCs的成脂分化，促進(jìn)ASCs的增殖和成骨分化。

4.4.6催產(chǎn)素和卡貝縮宮素：有研究顯示上述兩種激素能夠抑制BMSCs的成脂分化，但是對ASCs分化的影響尚不清楚。

4.5化學(xué)藥物

4.5.1 IBm（：IBMX可促進(jìn)ASCs的成脂分化，其機(jī)制前文已述，此處不再贅述。

4.5.2紫杉醇：Rachel等的研究顯示紫杉醇減緩人ASCs的增殖，導(dǎo)致生長停滯，降低其多向分化潛能，并且通過TNF-α通路增加了細(xì)胞凋亡。通過對LPL的檢測，發(fā)現(xiàn)紫杉醇降低了hASCs的成脂能力。此外，紫杉醇抑制ASCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，破壞血管新生，可能是導(dǎo)致化療患者中難愈性創(chuàng)面的原因。

4.5.3胰高血糖素樣肽（Glucagon-like peptide 1，GLP-1）：GLP-1是新的糖尿病藥物，可以降低血糖、保護(hù)胰島β細(xì)胞、降低體重等。有研究顯示高濃度的GLP-1（100nmol/L）抑制人ASCs的增殖和成脂分化，促進(jìn)甘油釋放和脂質(zhì)分解，但對脂質(zhì)合成無明顯作用。

4.6物理因素

有研究顯示低劑量的放射線和激光可刺激ASCs的成脂分化，其中p53蛋白扮演著至關(guān)重要的作用，但具體機(jī)制尚不明確。

4.7其他

4.7.1 Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）：TLRs在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮主要作用，ASCs表達(dá)TLR1-6和TLR9，TLR激動劑之一粘多肽抑制ASCs的成脂分化。

4.7.2富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）和富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）：PRP是全血離心后得到的富含血小板的自體血漿，PRF是全血離心后得到的富含血小板的纖維蛋白。PRP和PRF均可以促進(jìn)ASCs的成脂分化，其機(jī)制可能是血小板釋放出PDGF、VEGF、TGFβ和EGF等多種生長因子，同時其三維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)為ASCs提高適宜的微環(huán)境，促進(jìn)ASCs的增殖和成脂分化。

4.7.3人腺病毒36亞型（human adenovirus -36，Ad-36）：Ad-36感染動物后引起肥胖，Pasarica等的研究表明Ad 36通過上調(diào)磷脂酰肌醇3激酶信號通路，促進(jìn)ASCs的成脂分化及脂質(zhì)沉積。

4.7.4核心結(jié)合因子α1（core binding factor α1，CBFAl）：CBFA1是骨形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵性因子，高表達(dá)的CBFAl可降低LPL和PPAR的表達(dá)，抑制ASCs的成脂分化。

5結(jié)論與展望

利用藥物和化學(xué)試劑誘導(dǎo)ASCs成脂分化的方法已經(jīng)非常成熟，結(jié)合ASCs和脫細(xì)胞支架構(gòu)建組織工程組織是近來的研究熱點(diǎn)，但是脫細(xì)胞組織支架誘導(dǎo)ASCs的定向分化機(jī)制尚未完全明確。驗證ASCs分化的方法主要是油紅O染色和相關(guān)基因和蛋白的檢測，有學(xué)者利用不同分化底物的電阻抗實時監(jiān)測ASCs的分化，從學(xué)科交叉的角度提供了新的思路。影響ASCs成脂分化的因素主要包括供體因素、實驗因素、生長因子、激素、化學(xué)藥物、物理因素及其他因素等。某些細(xì)胞因子和激素對于ASCs成脂分化的影響具有濃度和時間效應(yīng)，即根據(jù)濃度和作用于成脂分化階段的不同，可能發(fā)揮促進(jìn)或抑制成脂分化的雙向作用。綜合利用上述影響因素，促進(jìn)ASCs的增殖和定向分化，在整形美容和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的意義和應(yīng)用前景。目前對于ASCs的成脂分化研究多局限于體外或動物實驗階段，臨床試驗較少且多處于起步階段，體外和體內(nèi)微環(huán)境、動物和人體內(nèi)微環(huán)境的差異，使得無法將目前的研究結(jié)果直接推至人體內(nèi)。體外培養(yǎng)的ASCs容易失去干性，表現(xiàn)為CD34從陽性變?yōu)殛幮?，因此如何保持ASCs的干性，控制其ASCs的定向分化。

此外，ASCs的分化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有很多重疊的信號通路，有研究顯示乳腺癌患者乳房切除后的自體脂肪移植可能通過HGF/c-Met信號通路導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)，此發(fā)現(xiàn)引起了較大爭論。Maclsaac等將ASCs注射入小鼠皮下，1年的時間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何干細(xì)胞致瘤現(xiàn)象。Krumboeck等認(rèn)為ASCS不會激活靜止的腫瘤細(xì)胞，但可能導(dǎo)致術(shù)后殘留的腫瘤細(xì)胞增殖。目前已經(jīng)有超過3000名患者利用脂肪移植重建乳房，但是由于缺少大規(guī)模的隨機(jī)對照試驗和長期隨訪，尚無足夠證據(jù)證明ASCs的絕對安全性。Claro等和Zimmerlan等提倡應(yīng)推遲富含ASCs的脂肪移植用于乳房重建，Gutowski等提出通過篩選BRACA1/2基因突變來排除脂肪移植的高?；颊?。不可否認(rèn)的是，ASCs旁分泌VEGF等生長因子，促進(jìn)血管形成，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中同樣可以發(fā)現(xiàn)VEGF信號通路的作用，因此ASCs移植后的致瘤風(fēng)險是亟需解決的問題。

編輯/張惠娟