黃銀云++胡新崗++郭廣富++徐婷婷

摘要：以蘇北地區(qū)某個(gè)體豬場疑似副豬嗜血桿菌感染的病豬為對象，從流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理變化剖檢、病原菌株分離鑒定、藥敏試驗(yàn)等多方面和多手段開展綜合診斷，確診為副豬嗜血桿菌病。

關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌；分離；鑒定；PCR

中圖分類號： S858.28文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0333-02

收稿日期：2015-05-04

基金項(xiàng)目：江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”。

作者簡介：黃銀云（1977—），女，江蘇泰州人，碩士，副教授，從事動物疫病防控研究及動物醫(yī)學(xué)教學(xué)工作。E-mail：gxh008@qq.com。副豬嗜血桿菌病是由豬上呼吸道常在菌副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的一種豬細(xì)菌性傳染病，該病由德國專家格拉澤氏（Glasser）于1910年首次報(bào)道，故也被稱為豬格氏?。℅lasser disease）[1]。副豬嗜血桿菌病常見于 5～8周齡斷奶后及保育階段的豬，發(fā)病率約為15%，病豬臨床主要表現(xiàn)為消瘦、發(fā)熱、呼吸困難、咳嗽、跛行、共濟(jì)失調(diào)等，剖檢病變主要為纖維素性胸膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎。臨床上該病多繼發(fā)于豬圓環(huán)病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征或與其混合感染，病死率可達(dá)50%，對仔豬和青年豬構(gòu)成了極大威脅。隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；⒓s化發(fā)展，該病已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)而備受關(guān)注的典型細(xì)菌性傳染病之一[2-4]。本試驗(yàn)結(jié)合臨床病例開展了副豬嗜血桿菌病的動物流行病學(xué)、病原學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)綜合診斷實(shí)踐，以期為養(yǎng)豬生產(chǎn)中及時(shí)有效地診斷與監(jiān)控該病提供可行方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料無菌采集蘇北地區(qū)某個(gè)體豬場疑似副豬嗜血桿菌病病豬具有典型病變的心包液、胸膜積液、肺組織。

1.1.2培養(yǎng)基與主要試劑胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA-YE）、胰蛋白胨大豆酵母肉湯培養(yǎng)基（TSB-YE）為紹興天恒生物科技有限公司產(chǎn)品。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片購自杭州微生物試劑公司。PCR反應(yīng)試劑由寶生物（大連）有限公司提供，細(xì)菌DNA抽提試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1流行病學(xué)調(diào)查通過查看豬場養(yǎng)殖檔案，掌握豬場的免疫程序、消毒措施、用藥情況、治療效果等，約談豬場工作人員以了解豬群日齡、進(jìn)場時(shí)間、發(fā)病時(shí)間、飲食情況、管理水平。深入豬舍進(jìn)行群體觀察和個(gè)體檢查，調(diào)查豬場周圍環(huán)境及當(dāng)?shù)貧夂蜃兓?，為副豬嗜血桿菌病的正確診斷提供流行病學(xué)依據(jù)。

1.2.2臨床癥狀觀察重點(diǎn)觀察患豬的發(fā)育情況、呼吸狀態(tài)、行走姿態(tài)、體表顏色、關(guān)節(jié)形態(tài)等有無異常。

1.2.3病理剖檢常規(guī)剖檢病死豬，重點(diǎn)觀察肝臟、脾臟、心臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)有無異常，胸腔有無積液、纖維素性滲出物，關(guān)節(jié)有無積液。

1.2.4細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌采集心包液、胸水、腹水及肺、脾的病變組織，分別劃線接種于添加NAD的TSA培養(yǎng)基、不添加NAD的TSA及TSB培養(yǎng)基，燭缸法37 ℃下培養(yǎng)18～24 h。

1.2.5組織觸片鏡檢無菌采集心血、胸水、腹水、肺組織制作抹片或觸片，革蘭氏染色并鏡檢。

1.2.6衛(wèi)星現(xiàn)象觀察挑取分離菌純培養(yǎng)物水平劃線接種于TSA培養(yǎng)基，再挑取金黃色葡萄球菌于培養(yǎng)基中央垂直劃1條線，置于37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.7分離株生化試驗(yàn)將分離菌株純培養(yǎng)物分別接種于預(yù)加入5 μL 0.01% NAD的麥芽糖、葡萄糖、半乳糖、棉籽糖、蜜二糖、L-阿拉伯糖、乳糖、蔗糖、木糖、果糖、核糖、吲哚、接觸酶、氧化酶、脲酶等微量生化反應(yīng)管[5]，以燭缸法于37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.2.8PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)[6]中的方法，按照副豬嗜血桿菌16S rRNA的基因序列合成1對引物，目的基因片段大小為822 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物序列為：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′；下游引物序列為：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′。

1.2.9PCR檢測PCR反應(yīng)體系共25 μL：上下游引物各 1.0 μL（均為10 pmol/μL）、菌液2.0 μL、MgCl2 1.5 μL（25 mmol/L）、緩沖液2.5 μL（不含Mg2+）、dNTPs混合物 2.0 μL（2.0 mmol/L）、Taq DNA聚合酶1.5 U，余量為超純水。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。試驗(yàn)設(shè)有陰性及陽性對照。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.10紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)取適量分離菌株的TSB純培養(yǎng)物，均勻涂布于含NAD的TSA固體培養(yǎng)基平板。將選取的20種藥敏紙片貼于平板內(nèi)，每皿貼5種，以燭缸法于 37 ℃ 下培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感，小于10 mm為不敏感或耐藥，兩者間為中度敏感。

2結(jié)果與分析

2.1流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

該豬場飼養(yǎng)商品豬400余頭，多批次引進(jìn)導(dǎo)致豬體質(zhì)量大小不一。2015年3月進(jìn)欄80余頭，從未接種過疫苗，閹割約3 d后接種了豬瘟、口蹄疫疫苗，隨即發(fā)病。病豬起初表現(xiàn)為發(fā)熱、厭食、皮膚發(fā)紅，之后皮膚發(fā)紫、干裂起痂皮；5 d左右波及全群，病豬體質(zhì)量減輕，嚴(yán)重者體質(zhì)量下降可達(dá)15 kg，至送檢時(shí)發(fā)病率達(dá)80%以上，死亡率約為35%。采用替米考星、氟苯尼考等藥物進(jìn)行治療，效果不明顯。

2.2臨床癥狀

臨床檢查可見病豬被毛粗亂、精神沉郁、食欲不振或廢食、體溫升高至40 ℃以上，部分病豬腹瀉或便秘。發(fā)病豬頭頸、腹下、尾部皮膚發(fā)紅（圖1），部分病豬的耳尖至耳背面、腹下、臀部、尾部皮膚發(fā)紺或干裂起痂（圖2），后肢關(guān)節(jié)腫大、癱瘓、伏臥不走。病豬消瘦、頻繁咳嗽，以腹式呼吸為主。

2.3病理剖檢變化

胸腔大量積液呈淡黃色，心包積液、擴(kuò)張，心包壁層附著纖維素性滲出物，形成“絨毛心”（圖3）。肺臟廣泛性肉變，肺間質(zhì)增寬，彈性變差（圖4）。腫大的關(guān)節(jié)內(nèi)有較多淡黃色液體（圖5）。腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血、壞死。脾臟腫大，呈暗紅色（圖6）。

2.4細(xì)菌培養(yǎng)特性

添加NAD的TSA平板上形成的菌落呈針尖狀，邊緣齊整、圓形隆起、光滑濕潤、無色透明，直徑約為1 mm；未添加NAD的TSA平板上不生長或生長不良。TSB中含NAD時(shí)，肉湯均勻渾濁，反之則肉湯透明?？梢?，該菌株對NDA具有依賴性。

2.5分離菌株的形態(tài)特點(diǎn)

分離菌株革蘭氏染色呈陰性，菌體散在或成雙、成鏈，形態(tài)不一。菌體細(xì)小，呈短小桿菌。

2.6衛(wèi)星現(xiàn)象

TSA平板上可見金黃色葡萄球菌線兩側(cè)有透明的灰白色露珠樣菌落，距線越近菌落越大，距線越遠(yuǎn)菌落越小，呈典型的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。分離菌株的生長對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的NAD（V因子）具有依賴性，符合副豬嗜血桿菌的生長特點(diǎn)。

2.7分離菌株的生化特點(diǎn)

分離菌株的生化反應(yīng)結(jié)果見表1。該結(jié)果符合副豬嗜血桿菌的生化特性。

2.8PCR檢測結(jié)果

以分離菌株的抽提DNA為模板進(jìn)行PCR檢測，得到副豬嗜血桿菌目的基因片段，片段大小為822 bp（圖7），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.9藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株對頭孢噻呋、頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松高度敏感，對強(qiáng)力霉素、丁胺卡那、安普霉素、紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素中度敏感，對青霉素G、氨芐西林、鏈霉素、替米考星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、新霉素均不敏感。

3結(jié)論與討論

副豬嗜血桿菌定居于豬上呼吸道，屬于條件性致病菌，有15個(gè)以上血清型[7]。臨床上須對患豬全身各病變部位廣泛采樣，才能準(zhǔn)確診斷該病。該豬場對仔豬群體閹割時(shí)不重視消毒，閹割后幾天內(nèi)進(jìn)行疫苗接種，造成仔豬抵抗力下降，進(jìn)而感染發(fā)病。該豬場引入的苗豬質(zhì)量不一，混群飼養(yǎng)，給防疫造成了很大困難，且發(fā)病時(shí)未及時(shí)隔離病豬，自行診斷用藥，這不僅是缺乏防疫意識的表現(xiàn)，也是使豬場發(fā)病率高達(dá)80%的重要原因。應(yīng)執(zhí)行自繁自養(yǎng)、全進(jìn)全出制度，每購進(jìn)一批苗豬必須隔離飼養(yǎng)并觀察一段時(shí)間，確認(rèn)無傳染性疫病、不攜帶病原后方可混群飼養(yǎng)。進(jìn)豬的首周內(nèi)循序漸進(jìn)更換飼料，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格進(jìn)行預(yù)防性消毒，減少應(yīng)激因素，使豬充分適應(yīng)新環(huán)境。待豬完全適應(yīng)并恢復(fù)正常生活后再進(jìn)行閹割、接種等工作。

副豬嗜血桿菌病屬于細(xì)菌性傳染病，理論上診斷該病最有效、最準(zhǔn)確的方法為分離鑒定菌株。然而，副豬嗜血桿菌對營養(yǎng)的要求較高[8]，故分離成功率一般不高；病豬是否用藥也有很大影響，使用過抗生素的病豬病原分離率較低；在實(shí)踐中，分離副豬嗜血桿菌的技術(shù)要求較高，耗時(shí)耗材。PCR技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、可靠性強(qiáng)的特點(diǎn)，在疫病診斷中輔以PCR檢測可極大提高準(zhǔn)確率。

臨床治療副豬嗜血桿菌病時(shí)，應(yīng)避免盲目、超劑量、單一長期用藥，最好于發(fā)病早期進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇高敏藥物并全群按療程注射給藥，避免治療不徹底及過度治療。如果藥物用足療程仍不見效，應(yīng)及時(shí)更換藥物，西藥無效時(shí)可嘗試中藥治療。臨床用藥要有整體觀念，治療副豬嗜血桿菌病時(shí)，采用抗生素消滅細(xì)菌是手段，使豬康復(fù)是根本目的；因此，治療時(shí)須綜合考慮抗菌、抗炎、抗過敏、退熱、防脫水、維持機(jī)體水鹽平衡各個(gè)方面，以獲得良好的臨床效果。

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