周朝東，白海嬌，黃哲

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

肝素樣品前處理方法比較及熒光定量PCR法鑒定肝素原料種屬來(lái)源

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

目的 比較肝素原料的3種前處理方法，即磁珠吸附法、瓊脂糖凝膠回收法和肝素酶降解法的優(yōu)劣，并對(duì)肝素原料的種屬來(lái)源進(jìn)行鑒別。方法 分別用磁珠提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和肝素酶對(duì)肝素原料進(jìn)行前處理，用商業(yè)化的豬、牛、羊種屬鑒別試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。采用熒光定量PCR法對(duì)3批肝素原料進(jìn)行種屬來(lái)源的鑒別，同時(shí)對(duì)豬源肝素中摻入的不同比例羊源肝素進(jìn)行檢出限的檢測(cè)。結(jié)果 3種不同的前處理方法以肝素酶降解法最快捷、最省時(shí)和最經(jīng)濟(jì)；種屬來(lái)源鑒別結(jié)果準(zhǔn)確。熒光定量PCR法檢測(cè)豬源肝素中摻入羊源肝素的檢出限是0.01%。結(jié)論 肝素酶降解法能簡(jiǎn)捷、快速、經(jīng)濟(jì)的解決肝素原料中樣品前處理的技術(shù)難點(diǎn)，結(jié)合商業(yè)化的豬、牛、羊鑒別試劑盒與熒光定量PCR儀能夠簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的對(duì)肝素原料種屬來(lái)源進(jìn)行鑒別。

磁珠提?。画傊悄z電泳；肝素酶；熒光定量PCR；肝素原料；種屬鑒別；質(zhì)量控制

肝素是一種抗凝劑，最早發(fā)現(xiàn)于肝臟，因此命名為肝素。它主要分布于哺乳動(dòng)物的肺、肝、小腸黏膜細(xì)胞內(nèi)，此外，在心、胰臟、胎盤、血液等也有分布[1-2]。肝素是一類糖胺聚糖，是由糖醛酸和葡萄糖胺以1→4鍵連接的重復(fù)二糖單位組成的多糖鏈復(fù)合物，含10～30個(gè)二糖單位，分子量4000～20000，平均分子量約為12000[3]。普通肝素又稱未分級(jí)肝素或標(biāo)準(zhǔn)肝素，以其為母體開(kāi)發(fā)了各種衍生物如低分子肝素、超低分子肝素以及標(biāo)準(zhǔn)肝素的修飾物等，廣泛應(yīng)用于臨床[4]。肝素的制備過(guò)程主要分為2個(gè)階段，即粗品的生產(chǎn)和精制。粗品的生產(chǎn)主要是采用離子交換樹(shù)脂法，有的還結(jié)合超濾技術(shù)進(jìn)行除雜和濃縮。精制過(guò)程主要是去除雜質(zhì)和脫色[5]。肝素是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，目前難以在短期內(nèi)通過(guò)化學(xué)合成。中國(guó)的生豬屠宰量占全球50%以上，是全球粗品肝素和肝素原料藥的主要生產(chǎn)國(guó)，也是全球最大的肝素原料出口國(guó)[2]。豬源肝素與人肝素結(jié)構(gòu)相同，不會(huì)產(chǎn)生蓄積毒性，有報(bào)道顯示，牛來(lái)源的肝素引起人血小板減少的不良反應(yīng)是豬源肝素的2倍[4]，同時(shí)反芻動(dòng)物會(huì)感染瘋牛病和瘋羊病，因此肝素來(lái)源以豬腸粘膜為最佳。

熒光定量PCR以其快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)在生物安全性和生物技術(shù)產(chǎn)品的遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)方面有很多應(yīng)用[6-7]。目前已經(jīng)有文獻(xiàn)[8-13]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[14]報(bào)道用PCR和熒光定量PCR對(duì)肝素原料進(jìn)行種屬來(lái)源的鑒別，鑒別的難點(diǎn)主要集中在樣品的前處理，因?yàn)楦嗡厥嵌嗵穷愇镔|(zhì)，會(huì)嚴(yán)重抑制后續(xù)PCR的反應(yīng)。本文旨在比較磁珠吸附法[10]、瓊脂糖凝膠電泳回收法[12]、肝素酶降解法[13]這3種樣品前處理方法的優(yōu)劣，并采用熒光定量PCR對(duì)肝素原料進(jìn)行種屬來(lái)源的鑒別，以期為藥品生產(chǎn)企業(yè)和藥品檢驗(yàn)部門提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料：3批豬源粗品肝素原料由天津紅日藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)分別為：20140205，20140514-1，20140514-2。3批精品肝素由天津生物化學(xué)制藥有限公司提供，批號(hào)分別為：01091106、01091109、01091201。1批羊源肝素由天津生物化學(xué)制藥有限公司提供，批號(hào)為Y1307009-1。豬、牛、羊基因組DNA提取于的新鮮豬、牛、羊肉(從超市購(gòu)得)。

1.1.2 主要試劑：血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司；磁珠提取和純化試劑盒(Chargeswitch gDNA Rendered Meat purification kit，Powerclean DNA clean-up kit)購(gòu)自Invitrogen公司；肝素酶I購(gòu)自sigma公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(EZNA Gel Extraction kit)購(gòu)自omega公司； Gelred染料購(gòu)自biotium公司；商業(yè)化的豬、牛、羊種屬鑒別試劑盒購(gòu)自北京寶科維食安生物技術(shù)有限公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器：GT-Sub瓊脂糖凝膠電泳儀購(gòu)自美國(guó)bio-rad公司；微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)NanoDrop購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Stepone熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 豬、牛、羊標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA提?。翰捎醚?細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒分別從新鮮豬、牛、羊肉中提取基因組DNA，微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度。

1.2.2 豬、牛、羊基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用滅菌超純水以10倍梯度逐級(jí)稀釋1.2.1提取好的基因組DNA，分別進(jìn)行熒光定量PCR，以DNA濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)作回歸方程，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 不同比例羊肝素的配制：把粗品羊肝素和粗品豬肝素分別研磨后按重量以不同比例混勻，分別為100%羊肝素、10%羊肝素、1%羊肝素、0.1%羊肝素和0.01%羊肝素。

1.2.4 磁珠吸附法對(duì)樣品進(jìn)行前處理：稱取粗品肝素約250 mg置2 mL 離心管內(nèi)，加入1 mL裂解緩沖液渦旋溶解，采用磁珠提取試劑盒提取DNA，并用 DNA純化試劑盒純化。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳回收法對(duì)樣品進(jìn)行前處理：①配制2%的瓊脂糖凝膠。②稱取粗品肝素原料約50 mg，加水200 μL渦旋使其溶解，沸水浴中加熱10 min，再置冰浴中5 min。③室溫10000 g/min離心10 min，取上清液。取20 μL上清液上樣電泳。100 V電泳1.5 h。④紫外燈下切下含有DNA的瓊脂糖凝膠，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.2.6 肝素酶降解法對(duì)樣品進(jìn)行前處理：①稱取300 mg肝素原料置15 mL離心管中，加入10 mL 50 mM Tris-HCl/5mM CaCl2(pH 8.0)溶液，渦旋使其溶解，作為溶液A。②取溶液A 100 μL加入9.9 mL 50 mM Tris-HCl/5mM CaCl2(pH 8.0)溶液使稀釋100倍，渦旋混勻，作為溶液B。③取溶液B 200 μL，85 ℃水浴中孵育5 min，冰浴中放置10 min，加入2 μL肝素酶I(含0.2單位的肝素酶I)，30 ℃水浴中消化0.5 h。④取出樣品進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 熒光定量PCR鑒定肝素種屬來(lái)源：PCR反應(yīng)體系及程序設(shè)置：2×Master Mix 10 μL，上下游引物預(yù)混液4 μL，探針2 μL，模板DNA 1 μL，無(wú)RNase的水 3 μL，總反應(yīng)體系共20 μL。程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：若樣品有典型擴(kuò)增曲線且Ct<30，則為陽(yáng)性結(jié)果；若樣品有典型擴(kuò)增曲線且30≤Ct≤34，則結(jié)果可疑，加大模板量或重新提取核酸再次實(shí)驗(yàn)；若樣品無(wú)典型擴(kuò)增曲線或Ct>34，則為陰性結(jié)果。每個(gè)樣本重復(fù)3次。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以水替代模板，其余不變，擴(kuò)增Ct>34或者無(wú)典型擴(kuò)增曲線即可。陽(yáng)性對(duì)照以標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA作為擴(kuò)增模板，有典型擴(kuò)增曲線且Ct<20有效。

2 結(jié)果

2.1 3種標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA的濃度和純度 測(cè)定結(jié)果顯示，豬基因組DNA濃度為99.7 ng/μL，純度A260/A280為1.86；?；蚪MDNA濃度為150.1 ng/μL，純度A260/A280為1.83；羊基因組DNA濃度為64.0 ng/μL，純度A260/A280為1.85。

2.2 q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程 豬基因組DNA濃度在997 fg/μL～99.7 ng/μL范圍內(nèi)其Ct值與模板DNA濃度的對(duì)數(shù)值呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=-3.2064x+41.037，相關(guān)系數(shù)r為0.996。擴(kuò)增效率E=105%，定量限約為997fg，檢出限約為9.97fg。

?；蚪MDNA濃度在1.5 pg/μL～150.1 ng/μL范圍內(nèi)其Ct值與模板DNA濃度的對(duì)數(shù)值呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=-3.8664x+43.462，相關(guān)系數(shù)r為0.999。擴(kuò)增效率E=81%，定量限約為1.5 pg，檢出限約為15 fg。

羊基因組DNA濃度在640 fg/μL～64 ng/μL范圍內(nèi)其Ct值與模板DNA濃度的對(duì)數(shù)值呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=-3.7278x+41.36，相關(guān)系數(shù)r為1。擴(kuò)增效率E=86%，定量限約為640 fg，檢出限約為0.64 fg。

2.3 對(duì)3種前處理方法得到的肝素樣本進(jìn)行q-PCR檢測(cè)

2.3.1 磁珠吸附法實(shí)驗(yàn)結(jié)果：3批粗品肝素中只含有豬源性成分，不含有牛、羊源性成分。見(jiàn)表1。

表1 磁珠吸附法提取粗品肝素的q-PCR結(jié)果Ct值

2.3.2 瓊脂糖凝膠電泳回收法實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 3批粗品肝素中只含有豬源性成分，不含有牛、羊源性成分。見(jiàn)表2。

表2 瓊脂糖凝膠電泳回收法提取粗品肝素的q-PCR結(jié)果Ct值

2.3.3 肝素酶降解法實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 3批粗品肝素中只含有豬源性成分，不含有牛、羊源性成分。見(jiàn)表3。

表3 肝素酶降解法處理的粗品肝素q-PCR結(jié)果Ct值

2.4 瓊脂糖凝膠電泳法比較精品肝素與粗品肝素的差別 按方法1.2.5中的瓊脂糖凝膠電泳法處理精品肝素和粗品肝素，可以看出粗品肝素中殘留有大量的DNA而精品肝素中則無(wú)肉眼可見(jiàn)的DNA。見(jiàn)圖1。

圖1 粗品肝素(左)和精品肝素(右)的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agrose gel electrophoresis pictures of crude heparin(left) and fine heparin(right)

2.5 3種前處理方法對(duì)含不同比例羊肝素結(jié)果的比較 摻有不同比例豬肝素的粗品羊肝素，按3種前處理方法進(jìn)行處理，熒光定量PCR結(jié)果顯示：磁珠吸附法ΔCt范圍從0.79～1.69；肝素酶降解法ΔCt范圍從3.21～3.98；瓊脂糖凝膠電泳回收法ΔCt范圍從1.91～4.58；表明肝素酶降解法的ΔCt值比其他2種前處理方法得到的ΔCt值相對(duì)均一，效果最好。見(jiàn)表4。

表4 不同比例羊肝素經(jīng)3種前處理方法的PCR結(jié)果

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：3種前處理方法都能得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且豬源鑒別試劑盒擴(kuò)增粗品肝素的Ct值均在20左右。從操作步驟上看，磁珠吸附法(53個(gè)操作步驟)最多，其次是瓊脂糖凝膠回收法(21個(gè)操作步驟)，最少的是肝素酶降解法(6個(gè)操作步驟)。從時(shí)間上看，肝素酶降解法最省時(shí)，半天即可完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)，而磁珠吸附法和瓊脂糖凝膠電泳回收法則最少需要一天時(shí)間。從實(shí)驗(yàn)成本看，耗費(fèi)最多的是磁珠吸附法，約100元/樣品，其次是瓊脂糖凝膠電泳回收法，約15元/樣品，最后是肝素酶降解法，約8元/樣品。從操作難易程度，筆者認(rèn)為瓊脂糖凝膠回收法較難，涉及到制膠、上樣、切膠等步驟，其次是磁珠吸附法，最簡(jiǎn)單的是肝素酶降解法。綜合考慮，肝素酶降解法不僅省時(shí)省力，也比較經(jīng)濟(jì)，適合大批量粗品肝素的檢測(cè)。

文獻(xiàn)報(bào)道[12]加入肝素酶的量為2個(gè)單位，消化時(shí)間18 h，本實(shí)驗(yàn)考查了不同肝素酶量(0.2單位和0.5單位)和不同消化時(shí)間(0.5、2、4、6、24 h)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)在樣品溶液加入0.2單位的肝素酶消化0.5 h即可有效去除肝素的抑制作用(結(jié)果未顯示)。

對(duì)3批粗品肝素進(jìn)行種屬來(lái)源的鑒別，均鑒定正確，但用3種前處理方法對(duì)企業(yè)提供的精品肝素進(jìn)行種屬來(lái)源的鑒別未得到理想結(jié)果，可能粗品肝素在精制過(guò)程中其殘留的DNA已被破壞殆盡(與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致)。另從2者外觀亦可以看出區(qū)別，粗品肝素有微小顆粒，顏色呈淡黃褐色，而精品肝素則是細(xì)粉呈白色。

綜上所述，通過(guò)比較3種前處理方法，以肝素酶降解法最簡(jiǎn)單、最省時(shí)、最經(jīng)濟(jì)，適合于藥企和藥品檢驗(yàn)部門對(duì)肝素樣品的質(zhì)量控制。

[1] 李鳳.肝素類藥物臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].北方藥學(xué)，2013，10(8)：44.

[2] 薛文東.國(guó)內(nèi)肝素類產(chǎn)品現(xiàn)狀概述[J].生物技術(shù)世界，2013(2)：73-74.

[3] 高寧國(guó)，程秀蘭，楊敬，等.肝素結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展，1999，19(5)：4-13.

[4] 姬勝利，桑青，張?zhí)烀?肝素的來(lái)源控制、結(jié)構(gòu)分析以及結(jié)構(gòu)與生物活性關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2012，47(9)：660-663.

[5] 姬勝利，張?zhí)烀?肝素與低分子肝素的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志，1996，17(5)：216-218.

[6] 張惟才，朱力，王玉飛.實(shí)時(shí)熒光定量PCR[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2013：1.

[7] Archie L.Applications of quantitative PCR in the biosafety and genetic stability assessment of biotechnology products[J].Mol Biotech,2002,82:279-300.

[8] 陳川，朱思宇，李麗，等.常規(guī)PCR法快速鑒別不同種屬來(lái)源的粗品肝素鈉[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2014，27(5)：705-708.

[9] Huang Q,Yao CY,Chen B,et al.Species-specific identification by inhibitor-controlled PCR of ruminant components contaminating industrial crude porcine heparin[J].Mol Cell Probes,2006,20:250-258.

[10] Huang Q,Xu T,Wang GY,et al.Species-specific identification of ruminant components contaminating industrial crude porcine heparin using real-time fluorescent qualitative and quantitative PCR[J].Anal Bioanal Chem,2012,402：1625-1634.

[11] 于智勇，丁鴿，丁小余，等.豬基源的肝素粗品及混淆品的AS-PCR及ARMS分子檢測(cè)[J] .藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43(5)：535-541.

[12] Sean P，Concannon P，Brett W，et al.A quantitative PCR method to quantify ruminant DNA in Porcine crude heparin[J].Anal Bioanal Chem，2011，399：757-762.

[13] Sharla MP,Yolanda LJ,Frank P,et al.Development of a multiplex real-time PCR assay for the detection of ruminant DNA in raw materials used for monitoring crude heparin for quality[OL] .www.fda.gov/animalveterinary/scienceresearch/toolsresources/ucm350289.htm.

[14] SN/T 1119-2002.進(jìn)口動(dòng)物源性飼料中牛羊源性成分檢測(cè)方法 PCR方法[S].2014.

(編校：吳茜)

Comparison of crude heparin pretreatment methods and identification of crude heparin from various species origins by quantitative PCR

ZHOU Chao-dong, BAI Hai-jiao, HUANG Zhe-suΔ

(Tianjin Institute for drug control, Tianjin 300070, China)

ObjectiveTo compare magnetic beads kit，agrose gel recovery kit and heparinase I three methods to purify the micro DNA from crude heparin, then use q-PCR to identify the species origins and select the best method.MethodsUsing magnetic beads kit，agrose gel recovery kit and heparinase I to purify micro DNA from crude heparin and combined the porcine，bovine and ovine identification kits to identify the species origins and conformed the minimum detection limit of different percentage of ovine crude heparin in porcine crude heparin.ResultsThree pretreatment methods all can solve the pretreatment difficulties and we found that the haparinase was the best method; the minimum detection limit was 0.01%of ovine crude heparin in porcine crude heparin.ConclusionThe heparinase method is the best pretreatment method and can successfully solve the pretreatment difficulties.Heparinase combine the porcine， bovine and ovine identification kits can identify the species origins from crude heparin.

magnetic beads; agrose gel electrophoresis; heparinase; quantitative PCR; crude heparin; species identification; quality control

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.60

周朝東，男，碩士，主管藥師，研究方向：生化藥品檢驗(yàn)與研究，E-mail：zhouchaodong0517@163.com；黃哲甦，通信作者，女，主任藥師，研究方向：生化藥品檢驗(yàn)與研究，E-mail：zcd82@163.com。

R446

A