林佳苗，姜建偉

(1.浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心(集團)臺州市中心醫(yī)院，浙江 臺州 318000；2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022)

Box-Behnken 效應面法優(yōu)化婦樂顆粒中綠原酸提取工藝

林佳苗1Δ，姜建偉2

(1.浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心(集團)臺州市中心醫(yī)院，浙江 臺州 318000；2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022)

目的 采用Box-Behnken 效應面法,優(yōu)選婦樂顆粒中綠原酸提取工藝條件。方法 采用HPLC測定婦樂顆粒中綠原酸的含量，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長327 nm；柱溫: 30 ℃; 流速: 0.9 mL/min；流動相:乙腈-0.2%磷酸溶液=15:85。以綠原酸提取率為指標，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken 試驗考察提取時間、料液比、提取次數(shù)對提取工藝的影響。結果 最佳提取工藝為加12倍量水提取3次，每次60 min; 綠原酸提取率為3.379%。結論 通過Box-Behnken 效應面法為評價系統(tǒng)優(yōu)選的提取工藝合理可行，預測性良好,為婦樂顆粒的應用提供參考。

婦樂顆粒；忍冬藤；綠原酸；提取工藝；Box-Behnken 效應面法

婦樂顆粒由忍冬藤、大血藤、甘草、大青葉、蒲公英、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡索和熟地黃等10味藥材制得，具有化瘀止痛、清熱涼血之功效。臨床多用于治療瘀熱蘊結所致的帶下病，癥見帶下量多、色黃、少腹疼痛，慢性盆腔炎等癥候[1]。君藥忍冬藤具有清熱解毒，消腫的功效。據(jù)文獻報道[2-3]：忍冬藤主要活性成分為有機酸類和環(huán)烯醚萜苷類，其中綠原酸含量較高，它具有抗病毒、抗菌、保肝利膽、增高白血球、抗菌抗感染、抗腫瘤、降血壓及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用[4-5]。目前，大多研究采用正交設計來優(yōu)化綠原酸的提取工藝[6-7]，未見Box-Behnken效應面法優(yōu)化提取工藝方面相關研究。

Box-Behnken(BBD)效應面法是常見的一種效應面優(yōu)化方法，適宜于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關問題，是一種連續(xù)分析實驗點以尋求最優(yōu)實驗條件的方法。BBD效應面法在小區(qū)域內用簡單一次或二次多項式模型來擬合較復雜的未知函數(shù)，找出預測的響應值最優(yōu)值以及相應的實驗條件。本試驗采用Box-Behnken效應面法對婦樂顆粒中綠原酸提取工藝影響的關鍵因素進行優(yōu)化的同時，旨在驗證該試驗設計法在中藥提取工藝應用中的可行性，也為婦樂顆粒標準化生產提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：婦樂顆粒(湖北襄陽隆中藥業(yè)集團有限公司生產，規(guī)格：6克/袋，6批)；綠原酸對照品(批號110753-201314，供含量測定用)購自中國食品藥品鑒定研究院；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑為分析純。

1.1.2 實驗儀器：DIONEX UltiMate 3000 系列高效液相色譜儀(SRD-3400A分析泵、WPS-3000自動進樣器、TCC-3000SD柱溫箱、VDW-3000檢測器、工作站：Chromeleon?Dionex)；色譜柱： Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；AB-135S型電子天平(METTLER-TOLEDO D=0.01 mg)。

1.2 方法

1.2.1 婦樂顆粒中綠原酸滲漉提取工藝：分別稱取照處方比例的忍冬藤、大血藤、甘草、大青葉、蒲公英、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡索等九味藥材，加水煎煮2次，合并煎液，縮至適量，加水定容至1000 mL，搖勻、過濾。測定濾液中綠原酸的質量濃度，計算綠原酸提取率[提取率=(濾液中綠原酸的質量濃度×濾液體積)/忍冬藤質量×100%]。

1.2.2 色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液=15:85；流速： 0.9 mL/min；進樣體積： 10 μL；柱溫： 30 ℃；檢測波長： 327 nm。

1.2.3 婦樂顆粒中綠原酸的含量測定

① 對照品溶液的制備：取經(jīng)P2O5真空干燥24 h綠原酸對照品適量，精密稱定，置于棕色容量瓶中，加入甲醇制成每1 mL含46.3 μg的綠原酸對照品溶液，置涼暗處保藏，備用。

② 供試品溶液的制備：精密量取“1.2.1”項下藥材濃縮液2.0 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

③ 標準曲線的制備：精密吸取綠原酸對照品溶液2、4、8、16、25、30 μL注入液相色譜儀，記錄綠原酸的峰面積。以對照品進樣量X(ng) 為橫坐標，峰面積Y為縱坐標進行線性回歸。

④ 精密度試驗精密：吸取綠原酸對照品溶液，重復進樣6次，每次10 μL，記錄色譜圖。

⑤ 穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、15、18、24 h按相應色譜條件測定，記錄色譜圖。

⑥ 加樣回收試驗：按照婦樂顆粒處方，取已知含量忍冬藤和其它九味藥材共6份，按照“1.2.1”和“1.2.3②”方法，分別精密加入綠原酸對照品各適量，依“1.2.2”項下色譜條件測定，測定峰面積，并計算回收率。

1.2.4 婦樂顆粒中綠原酸提取工藝的優(yōu)化

① 單因素試驗:料液比考察：取忍冬藤藥材約20 g，其它九味藥材取量按照處方比例推算，提取時間為60 min/次，提取2次，分別按料液比1:6，1:8，1:10，1:12，1:14 條件進行提取，依“1.2.2”項下色譜條件測定，計算綠原酸提取率。

提取時間考察：取忍冬藤藥材約20 g，其它九味藥材取量按照處方比例推算，按料液比1:10，提取2次，考察提取30、40、60、90、100 min 綠原酸的提取率。

提取次數(shù)考察：取忍冬藤藥材約20 g，其它九味藥材取量按照處方比例推算，料液比1:10，提取時間定為60 min，逐步提取1，2，3，4 次，依“1.2.2”項下色譜條件測定，計算綠原酸提取率。

② Box-Behnken 效應面法優(yōu)化婦樂顆粒提取工藝：提取工藝方案設計：采用軟件Design-Expert 8.0.5 中的Box-Behnken 試驗設計原理，綜合單因素試驗結果，以提取次數(shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C) 為因素，綠原酸提取率(%)為評價指標，設計三因素三水平17個試驗點的響應面分析。

模型的建立及顯著性檢驗：以綠原酸提取率為因變量，提取時間、料液比和提取次數(shù)為自變量，使用Design Expert 8.0.5 軟件對各因素進行二次多元回歸擬合，并對模型進行顯著性檢驗。

提取工藝的響應面分析與優(yōu)化：根據(jù)二元多次模型，采用Design-Expert軟件分析，作出相應的曲面圖和等高線圖，并對曲面圖和等高線圖進行分析，優(yōu)化提取工藝。

最佳提取工藝確定及驗證試驗：用Design-Expert 8.0.5 統(tǒng)計軟件求解回歸方程可以推測出綠原酸最佳提取工藝，并預測出提取率值。

2 結果

2.1 婦樂顆粒中綠原酸的含量測定方法學考察結果

2.1.1 標準曲線結果： 綠原酸回歸方程為Y=2.36X-0.05，R2=0.9997。表明綠原酸在0.0923～1.389 μg 范圍內線性關系良好。

2.1.2 精密度試驗精密結果： RSD為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗結果：綠原酸的峰面積RSD為0.5%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.1.4 加樣回收試驗結果：結果綠原酸平均回收率99.4%，RSD=0.5%(n=6)，表明本方法具有較好的加樣回收率。見表1。

表1 綠原酸回收率測定結果(n=6)

2.2 婦樂顆粒中綠原酸提取工藝的優(yōu)化結果

2.2.1 單因素考察結果：

① 料液比考察結果：綠原酸提取率分別為2.11%、2.56%、2.87%、3.32%、3.30%。表明當提高料液比有利于綠原酸的提取，當料液比達到1:12時，綠原酸基本提取完全。

② 提取時間考察結果：綠原酸提取率分別為2.06%、2.89%、3.26%、3.32%、3.30%。表明60 min內綠原酸提取率隨提取時間的增而增加，當提取時間大于60 min時，再繼續(xù)提取，綠原酸提取率沒有顯著增加，可以推斷60 min為最佳提取時長。

③ 提取次數(shù)考察結果：結果綠原酸提取率(2次及以后綠原酸累加計算)分別為1.26%、2.72%、3.30%，3.32%，說明忍冬藤提取3～4 次才可以提取完全。

2.2.2 Box-Behnken 效應面法優(yōu)化婦樂顆粒提取工藝結果

① 提取工藝方案設計結果：優(yōu)化方案及試驗結果見表2。

表2 提取工藝Box-Behnken 試驗設計與響應值

② 模型的建立及顯著性檢驗結果：擬合模型如下：綠原酸提取率Y(%)=3.32+0.026A+0.044B+0.087C+0.0025B+0.005AC -0.024A2+0.011B2-0.092C2，A，B，C 為自變量，分別代表提取次數(shù)、料液比、提取時間。擬合方程的相關系數(shù)R2=0.9522，說明設計模型擬合程度良好，可以用于忍冬藤中綠原酸的提取率的預測。模型的變異系數(shù)(CV)為0.90%，在可接受范圍。對二次多項模型進行方差分析可知(見表3)，所建立模型有意義 (P<0. 05)，失擬項P=0.405，無統(tǒng)計學意義。C-提取時間一次項、B-料液比一次項、提取時間二次項達到極顯著水平(P<0.01)，對綠原酸提取率影響明顯。

表3 二元多次回歸擬合Box-Behnken 實驗設計的方差分析結果

*P<0.05表示顯著性差異；**P<0.01表示極顯著性差異

③ 提取工藝的響應面分析與優(yōu)化結果：響應面如圖1～3所示。圖1可以看出，料液比達到1:12時，綠原酸提取最完全，當提取次數(shù)達到大約2.5次時，曲線達到高點，即綠原酸提取率最高，隨后有所下降；圖2顯示的是提取時間和提取次數(shù)對綠原酸提取率的影響，由圖可以看出，提取時間對提取率的影響呈曲線趨勢，先大后小，大概在60 min達到頂峰。

圖1 料液比與提取次數(shù)對綠原酸提取率的響應面圖和等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour plot of liquid ratio and extraction times

圖2 提取時間與提取次數(shù)對綠原酸提取率的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot of extraction time and extraction times

圖3 提取時間與料液比對綠原酸提取率的響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of extraction time and solid-liquid ratio

④ 最佳提取工藝確定及驗證試驗結果婦樂顆粒中綠原酸最佳提取工藝為： 提取次數(shù)為3，料液比為1:12，提取時間為60 min，此條件下綠原酸與預測值為3.379%。結合實際試驗，將料液比定為1 ：12，提取時間定為60 min，提取3 次，進行提取工藝驗證試驗(n=3)，實際測得綠原酸提取率為3.372%，RSD=0.1%(n=3)，說明該模型可靠。

3 討論

綠原酸具有抗病毒、抗菌、抗感染等多種功效，具有很好臨床應用價值。婦樂顆粒處方中忍冬藤藥材含量綠原酸，目前，也有相關文獻[8]對忍冬藤中綠原酸開展研究，但是提取方法鮮有報道，本文利用Box-Behnken 效應面法設計并優(yōu)化忍冬藤藥材中綠原酸提取工藝，確立最佳提取工藝參數(shù)，為提高婦樂顆粒臨床應用范圍提高參考。

本研究考察提取次數(shù)、提取時間和料液比三因素對綠原酸提取率的影響，利用Box-Behnken效應面法進行實驗設計，并按照各試驗點條件測出相應提取率，采用二元多次方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過二元多次模型來推測最佳工藝條件。BBD效應面法不僅考察因素與響應值之間作用，還能考察各因素間的相互作用，方法簡便合理，試驗次數(shù)較少，與正交試驗和均勻設計相比較，更加直觀、合理，精密度和準確度也大大地提高。采用模型推測最佳方法實驗所得提取率和預測值接近，進一步驗證方法的準確性。

[1] 中華人民共和國藥典[M].2015， Vol I(一部)：896.

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[3] 張聰，殷志琦，葉文才，等. 忍冬藤的化學成分研究[J].中國中藥雜志，2009，34(23)：3051-3053.

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(編校：譚玲)

Optimization of processing parameters for extraction of chlorogenic acid in Fule Granula using Box-Behnken experimental design

LIN Jia-miao1Δ, JIANG Jian-wei2

(1. Zhejiang Taizhou Grace (group) Medical Center Taizhou Center Hospital, Taizhou 318000, China；2. Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, China)

ObjectiveTo optimize the processing parameters for the extraction of chlorogenic acid in Fule Granula by Box-Behnken experimental design. MethodsThe content of chlorogenic acid in Fule Granula was determination. The separation was performed on a Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18column(4. 6 mm ×250 mm, 5 μm), and column temperature 30 ℃. Aetonitrile-0.2% H3PO4was used as the mobile phase. The detection wavelength was at 327 nm. A three-factor and three-level Box-Behnken experimental design was employed to investigate effects of extraction time, solid-liquid ratio and extraction times on composite score of extracting amount of chlorogenic acid. ResultsOptimum process conditions were as follows:12 times the amount of water extracted three times, each time 60 min; chlorogenic acid extraction rate of 3.379%.ConclusionThis optimized extraction technology has good predictability by Box-Behnken experimental design, and overall desirability, it provides a reference for application of Fule Granula.

Fule Granula; lonicerae japonicae caulis; chlorogenic acid; extraction technology; Box-Behnken experimental design

林佳苗，通信作者，女，本科，主管藥師，研究方向：藥物制劑工藝，E-mail：3079133348@qq.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.62