曾云英++萬強++馬存琛

摘要：以矮牽牛為外植體，將不同種類和濃度的抑菌劑加入培養(yǎng)基中，確定適合矮牽牛開放式快速繁殖的最佳抑菌劑種類和濃度。結(jié)果表明，Y1和Y2均可作為矮牽牛開放式快速繁殖的抑菌劑，Y1濃度為2.5%時抑菌效果最佳且外植體生長良好。接種器具用抑菌劑浸泡消毒5 min后在空氣消毒后的制劑間接種可以達到超凈工作臺的效果。

關(guān)鍵詞：矮牽牛；開放式快速繁殖；抑菌劑；接種條件

中圖分類號： S681.604+.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0079-02

植物開放式快速繁殖是指在抑菌劑的作用下，使植物快速繁殖脫離嚴格無菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺，用普通容器代替組培瓶，在自然、開放的有菌環(huán)境下進行植物的快速繁殖。該技術(shù)實現(xiàn)了把植物組培從無菌實驗室移到自然環(huán)境中進行，可降低植物快繁要求、簡化快繁程序、降低快繁成本、提高快繁效率。當前關(guān)于植物開放式快速繁殖的研究重點是圍繞污染控制問題展開，抑菌劑的選擇成為開放式快速繁殖是否成功的關(guān)鍵。利用抗生素、農(nóng)藥、家用消毒劑、植物提取物等作為抑菌劑方面的研究均有報道，崔剛等首次采用植物提取液作為抑菌劑對葡萄莖段進行培養(yǎng)，成功獲得外植體，由此開始快速繁殖的相關(guān)研究[1]。陳瑞丹等以植物混合提取液作為抑菌劑對梅花莖段進行培養(yǎng)[2]。丁國昌等以退菌特為抑菌劑獲得黑木相思開放式快速繁殖的再生苗，污染率僅為9.3%[3]；解輝等以家用消毒劑次氯酸鈉作為香蕉開放式快速繁殖的抑菌劑，認為濃度在0.01%以上可有效抑制培養(yǎng)基的污染[4]；趙青華等將特制的H198抑菌劑400倍液添加到培養(yǎng)基中，獲得魔芋的再生苗[5]；王趙玉等比較生物農(nóng)藥大蒜素與化學(xué)農(nóng)藥代森錳鋅的抑菌效果，認為適當濃度的大蒜素和代森錳鋅抑菌效果均比較理想且不會對植物生長產(chǎn)生副作用[6]。王丹用山梨酸鉀作為抑菌劑獲得紅豆杉的再生苗[7]。本研究以2種復(fù)合抑菌劑（Y1，Y2）作為矮牽牛開放式快速繁殖的抑菌劑，研究適合矮牽牛外植體生長的最佳抑菌劑種類和濃度，以及合適的接種操作方法，以期建立其開放式快速繁殖技術(shù)體系，簡化快速繁殖程序，降低快速繁殖成本，為植物的低成本工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

植物材料為矮牽牛莖尖和莖段。抑菌劑為復(fù)合型抑菌劑，Y1由植物提取，Y2是化學(xué)合成制劑，均由上海宇涵生物科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1抑菌劑篩選以MS+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA為矮牽牛培養(yǎng)基，將不同濃度的Y1、Y2抑菌劑分別添加到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不經(jīng)過高溫高壓滅菌直接接種。Y1抑菌劑濃度為 1.25、2.50、3.50 mL/L，Y2抑菌劑的濃度為0.25、0.50、1.00 mL/L。以傳統(tǒng)制備方法即高溫高壓滅菌為對照。

1.2.2接種條件的篩選接種盤、鑷子、刀片不同處理：高壓滅菌、乙醇浸泡消毒、抑菌劑浸泡消毒、不消毒。接種環(huán)境：超凈工作臺接種、空氣消毒后的制劑間接種。以快速繁殖的傳統(tǒng)接種方法為對照。

1.2.3統(tǒng)計與分析材料接種培養(yǎng)后，在一定時間內(nèi)對材料的污染率、芽分化率以及外植體生長狀況作觀察記載及必要的統(tǒng)計。本試驗中，污染率=污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；分化率=已分化的外植體數(shù)/接種后成活外植體數(shù)×100%。

統(tǒng)計相關(guān)的數(shù)據(jù)，采用SPSS for windows 10.0統(tǒng)計分析軟件包對試驗觀察數(shù)據(jù)進行分析。

2結(jié)果與分析

2.1抑菌劑種類及濃度對矮牽牛快速繁殖的影響

試驗于2015年3月11日進行，接種后定期觀察外植體生長狀況，接種后7、14、20 d分別統(tǒng)計外植體污染情況，接種后30 d觀察統(tǒng)計外植體分化狀況。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)相比，污染率一直是植物開放式快速繁殖的一大難題。從表1可以看出，傳統(tǒng)的滅菌方式培養(yǎng)20 d時污染率為0。加了抑菌劑的培養(yǎng)基在一定程度上能控制污染，但達不到高壓滅菌的效果。Y1、Y2在低濃度時污染率較高，濃度高時基本能達到與傳統(tǒng)滅菌方式一樣的無菌效果。培養(yǎng)7 d時，不加抑菌劑和不進行高壓滅菌的CK2污染率最高，為80%，其次是Y1濃度為1.25 mL/L時，污染率為13%。培養(yǎng)14 d時，Y1濃度為 2.50 mL/L、Y2濃度為0.25 mL/L時開始出現(xiàn)污染，之后污染逐漸加重，20 d時污染率分別達到33%和20%。由此可見，14 d是污染加重的一個拐點，為了減少污染，可在培養(yǎng)14 d左右更換培養(yǎng)基。

抑菌劑對外植體分化率及生長狀況的影響見表2。從表2可以看出，隨著Y1濃度的升高，外植體的分化率減少，Y1濃度為1.25、2.50 mL/L時分化率差異不顯著。本試驗所設(shè)的Y2等3個濃度均不利于外植體的分化，外植體只伸長生長，并且隨Y2濃度升高，外植體黃化率增高，直至全部死亡。

比較Y1和Y2的污染率及外植體生長狀況可以看出Y2作為抑菌劑可以很好的抑菌污染，但對外植體的傷害很大，很小的濃度就能使外植體整株黃化甚至死亡。Y1抑菌力不及Y2，但對外植體傷害小，外植體能正常生長與分化。適合矮牽牛開放式快速繁殖的抑菌劑種類為Y1、濃度為2.5 mL/L。

2.2接種條件對矮牽牛外植體生長及分化的影響

以抑菌效果最好的濃度為2.50 mL/L的Y1為抑菌劑添表2抑菌劑種類及濃度對矮牽?？焖俜敝车挠绊?/p>

抑菌劑種類抑菌劑濃度（mL/L）接種瓶數(shù)（瓶）分化率（%）外植體生長狀況Y11.2515100aA未污染的外植體生長良好，分化正常2.501593aA外植體生長良好，分化正常3.501553bB外植體生長纖細，部分分化Y20.25150cC外植體老葉萎黃，不分化，伸長生長緩慢0.50150cC外植體不生長，葉片萎黃，逐漸死亡1.00150cC外植體不生長，葉片萎黃，逐漸死亡CK1不加抑菌劑，高壓滅菌10100 aA未發(fā)生污染，外植體生長良好，正常分化CK2不加抑菌劑，不高壓滅菌100cC污染嚴重注：各處理芽分化率進行LSD檢驗，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。

加到矮牽牛開放式快速繁殖的培養(yǎng)基中，在不同的接種條件下進行接種，觀察外植體污染情況和生長狀況，以確定接種條件對抑菌效果的影響。試驗結(jié)果表明，接種器具用500 mg/L的Y2浸泡消毒5 min可以達到徹底消毒的效果，制劑間空氣消毒后接種和超凈工作臺接種污染狀況沒有差異，接種器具經(jīng)抑菌劑浸泡消毒后在空氣消毒后的制劑間進行接種與傳統(tǒng)的在超凈工作臺里進行的接種效果一樣。制劑間空氣消毒可作為矮牽牛的開放式快速繁殖的接種環(huán)境（表3）。

3結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，Y1、Y2在植物組織培養(yǎng)中的抑菌效果良好，Y2的抑菌效果更佳，但Y2在抑菌的同時，對外植體的傷害較大，外植體出現(xiàn)生長緩慢，葉片黃化，最后全株黃化死亡。Y1由植物提取液組成，抑菌效果相對Y1較弱，但對外植體不產(chǎn)生傷害，外植體正常生長和分化。綜合抑菌能力和外植體的生長狀況，Y1濃度為2.5%是最佳的抑菌劑。接種器具用Y2浸泡消毒5 min后在空氣消毒后的制劑間進行接種，可以替代在超凈工作臺接種。化學(xué)抑菌劑在抑菌的同時影響外植體生長、甚至導(dǎo)致外植體整株死亡，植物提取的抑菌劑對外植體的傷害相對小[8-9]，發(fā)現(xiàn)更多更有效的植物性抑菌劑是今后工作的重點。

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