劉　瑋， 張　倩， 孫　婷， 覃盼盼， 劉　濤， 王躍華

(1.綿陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所， 四川 綿陽(yáng)　621000； 2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都　610106)

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貝母組培物提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉瑋1， 張倩2， 孫婷2， 覃盼盼2， 劉濤2， 王躍華2

(1.綿陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所， 四川 綿陽(yáng)621000； 2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都610106)

摘要：目的:研究貝母組培物提取物的質(zhì)量控制方法. 方法：采用薄層色譜法，紫外分光光度法進(jìn)行定性鑒別和定量鑒別，通過(guò)測(cè)定總灰分、酸不溶灰分對(duì)提取物所含雜質(zhì)的量進(jìn)行控制，采用熱浸法對(duì)水溶性浸出物和醇溶性浸出物的含量進(jìn)行測(cè)定. 結(jié)果：定性鑒別薄層色譜特征明顯，專屬性強(qiáng)；水溶性浸出物不少于72.69%，醇溶性浸出物不少于75.95%，總灰分的檢查限度為不超過(guò)11.89%.建立了貝母組培物提取物中西貝母堿的含量測(cè)定方法，回歸方程為Y=7.7591X+0.0437(R2=0.9991).平均加樣回收率為98.7541%，回收率RSD=1.3067%.結(jié)論：定性鑒別和含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可有效控制貝母組培物提取物的質(zhì)量.

關(guān)鍵詞：薄層色譜法；貝母組培物提取物；西貝母堿；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

0引言

川貝母為百合科貝母屬的多種植物的干燥鱗莖，具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳之功效，可用于治療痰熱咳喘，咯痰黃稠等證[1].川貝母目前屬于瀕危藥材[2-4]，為了解決資源短缺問(wèn)題，本課題組采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法獲得了川貝母組培藥材，其中藥材提取物具有一系列的優(yōu)勢(shì)[5]，同時(shí)，本課題組已建立了川貝母組培物提取物的工藝路線.為了更好地控制川貝母藥材質(zhì)量，本研究對(duì)其進(jìn)行了總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、重金屬等項(xiàng)目的測(cè)定，并以西貝母堿為指標(biāo)性成分進(jìn)行定性鑒別和含量測(cè)定，建立了貝母組培物提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，擬為貝母組培物提取物的質(zhì)量控制提供依據(jù).

1儀器與試藥

1.1藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)所用藥品與試劑包括：川貝母組培物提取物，自制(批號(hào)，20140328、20140601、20140605)；西貝母堿對(duì)照品(批號(hào)，110767-201107)、貝母素乙(批號(hào)，110751-201110)、貝母素甲(批號(hào)，110750-201110)，均購(gòu)自國(guó)家食品藥品檢定研究所；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)) ，三氯甲烷、甲醇、氨水均為分析純.

1.2儀器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BS-6KH電子天平(上海良平儀器有限公司)，UV-1100D型紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)有限公司)，RE-501恒溫水油浴鍋(成都康宇科技有限公司)，SH2-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵，真空干燥箱(北京科偉儀器有限公司).

2方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.1對(duì)照品制備.

取西貝母堿對(duì)照品適量，加三氯甲烷制成每1 mL含0.2 mg溶液，作為對(duì)照品溶液；取貝母素乙對(duì)照品適量，加三氯甲烷制成每1 mL含1 mg溶液，作為對(duì)照品溶液.

2.1.2對(duì)照組制備.

取貝母組培物粉末10.0 g,加濃氨試液10 mL,密塞，浸泡1 h，加二氯甲烷40 mL,超聲處理1 h，再加20 mL二氯甲烷，超聲5～6 min.濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為對(duì)照組.

2.1.3供試品制備.

取各批貝母組培物的提取物1.0 g，加濃氨試液10 mL，密塞，浸泡1 h，加二氯甲烷40 mL，超聲處理1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為供試品溶液.

2.1.4實(shí)驗(yàn)方法.

吸取適量供試品和對(duì)照品分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯—甲醇—濃氨試液—水(18∶2∶1∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，依次噴以稀硫酸鉍鉀和亞硝酸鈉乙醇試液，供試品與對(duì)照品在相同位置顯相同顏色斑點(diǎn)，結(jié)果如圖1所示.

1.西貝母堿對(duì)照品；2.貝母素乙對(duì)照品；3、4、5.樣品；6.貝母組培物

圖1貝母組培物提取物TLC

2.2總灰分

本實(shí)驗(yàn)按《中國(guó)藥典》(2010版) 一部附錄Ⅸ K測(cè)定總灰分.根據(jù)3批9組樣品測(cè)定結(jié)果分析，測(cè)定結(jié)果最高值11.61%，平均值9.90%.故暫定總灰分的檢查限度為不超過(guò)11.88%.

2.3酸不溶灰分

本實(shí)驗(yàn)按《中國(guó)藥典》(2010版) 一部附錄Ⅸ K測(cè)定酸不溶灰分.根據(jù)3批9組樣品測(cè)定結(jié)果分析，測(cè)定結(jié)果最高值0.15%，平均值0.13%.故暫定總灰分的檢查限度為不超過(guò)0.16%.

2.4浸出物

2.4.1水溶性.

本實(shí)驗(yàn)按《中國(guó)藥典》(2010版) 一部水溶性浸出物熱浸法測(cè)定.根據(jù)3批6組樣品測(cè)定結(jié)果分析，均值90.86%.故暫定水溶性浸出物不少于72.69%.

2.4.2醇溶性.

本實(shí)驗(yàn)按《中國(guó)藥典》(2010版) 一部醇溶性浸出物熱浸法測(cè)定.根據(jù)3批6組樣品測(cè)定結(jié)果分析，平均值94.93%.故暫定醇溶性浸出物不少于75.95%.

2.5含量測(cè)定

2.5.1對(duì)照品溶液制備.

取貝母對(duì)照品(西貝母堿)約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加三氯甲烷適量并稀釋至刻度，搖勻，得0.2 mg/mL對(duì)照品溶液.

2.5.2最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定.

取樣品溶液，以三氯甲烷∶溴甲酚綠∶水(30∶2∶10)作為空白對(duì)照進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，對(duì)照品與供試品在波長(zhǎng)412 nm處均有較大吸收，故選擇412 nm為最大吸收波長(zhǎng)，其圖譜如圖2所示.

a.空白對(duì)照；b.對(duì)照品；c.供試品

圖2貝母組培物提取物紫外全波長(zhǎng)掃描圖

2.5.3樣品的處理方法考察.

取貝母組培物的提取物0.3 g(批號(hào)，20140328)，精密稱定，以一已知濃度的對(duì)照品作為參照，通過(guò)不同的方法處理后定容，比較吸光度，即可知濃度大小.確定回流比超聲處理吸光度高，回流2 h較1 h、1.5 h時(shí)吸光度高，加入三氯甲烷∶甲醇(4∶1)混合溶液40 mL較加入相同溶液20 mL吸光度高.

綜上所述，樣品的處理方法為：取樣0.3 g，精密稱定，精密加入3.0 mL氨水回流2 h，加入三氯甲烷∶甲醇(4∶1)混合液40 mL回流2 h，放冷，濾過(guò)，濾液置50 mL量瓶中，加三氯甲烷∶甲醇(4∶1)混合溶液至刻度，搖勻，待用.

2.5.4供試品溶液制備.

經(jīng)單因素考察方法處理制得的樣品分別精密量取3.0 mL，置于25 mL容量瓶中，水浴上蒸干，加三氯甲烷10 mL,精密加水5 mL，再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30 min.取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過(guò)，取續(xù)濾液，待用.

2.5.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制.

精密吸取西貝母堿對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，精密加水5 mL，加0.05%溴甲酚綠緩沖液2 mL,密塞，劇烈振搖，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30 min，取續(xù)濾液，按紫外分光光度法在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定Abs，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程，Y=0.7591X+0.0437(R2=0.9991).結(jié)果表明，西貝母堿在0.002～0.02 mg與吸光度呈良好的線性關(guān)系.

2.5.6精密度實(shí)驗(yàn).

吸取同一樣品溶液6份， 按“2.5.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)得其吸光度RSD=1.15%，表明本方法精密度較好.

2.5.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn).

取貝母組培物的提取物0.3 g，精密稱定，制成樣品溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、30 min時(shí)依法測(cè)定Abs，其吸光度RSD=1.28%，表明供試品溶在30 min內(nèi)穩(wěn)定性較好.2.5.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn).

取貝母組培物的提取物0.3 g，精密稱定，制成樣品溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定Abs，計(jì)算西貝母堿含量，其RSD=1.49%，表明本方法重復(fù)性較好.

2.5.9加樣回收率實(shí)驗(yàn).

精密稱取貝母組培物提取物(批號(hào)，20130328，含西貝母堿，12.04 mg/g)樣品6份，等量加入西貝母堿對(duì)照品，制成樣品溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定Abs，計(jì)算回收率.西貝母堿的平均回收率為98.75%，回收率RSD=1.31%，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1　西貝母堿加樣回收率

2.5.10樣品測(cè)定.

取3批貝母組培物的提取物0.3 g，精密稱定，制成樣品溶液，再按“2.5.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定Abs，計(jì)算樣品中西貝母堿的含量，每批藥材各平行操作2份，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2　貝母組培物提取物中西貝母堿含量測(cè)定

根據(jù)6批樣品測(cè)定結(jié)果分析，測(cè)定結(jié)果最高值為1.1255%，平均值為1.1091%，故暫定西貝母堿的含量不得低于0.8873%.

3討論

采用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行中藥材培育是解決資源緊缺中藥材供給的一種有效方式.本課題組建立了貝母組培物的培育方法，能夠規(guī)?；厣a(chǎn)貝母組培物.為了有效保存藥材，課題組對(duì)貝母組培物提取物制備工藝進(jìn)行了研究，目的是為了保證提取物的質(zhì)量，并建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).

參照《中國(guó)藥典》2010版(一部) 中貝母的鑒別方法,采用硅膠G對(duì)貝母組培物的提取物進(jìn)行薄層色譜研究，并以貝母素甲、貝母素乙、西貝母堿為對(duì)照品，以乙酸乙酯—甲醇—氨水—水(18∶2∶1∶0.1)為展開(kāi)劑,分別對(duì)3批提取物采用薄層鑒別方法進(jìn)行研究.結(jié)果表明，用甲醇直接溶解樣品分離現(xiàn)象不明顯，沒(méi)有出現(xiàn)具體的斑點(diǎn)，只有一條展開(kāi)帶；而經(jīng)氨水浸泡，再超聲處理的樣品分離效果較好.

有文獻(xiàn)采用HPLC-ELSD法測(cè)定西貝母堿的含量[7]，本研究參照《中國(guó)藥典》的方法，采用紫外分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該法也可較好地測(cè)定西貝母堿的含量.

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Quality Standards for Extracts of Fritillaria Tissue Cultures

LIUWei1,ZHANGQian2,SUNTing2,QINPanpan2,LIUTao2,WANGYuehua2

(1.Institute for Food and Drug Control, Mianyang 621000, China;2.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

Abstract:The paper is going to study the quality control of the extracts of fritillaria tissue cultures.TLC and ultraviolet spectrophotometry are used for qualitative and quantitative identification.By measuring the total ash and acid insoluble ash,the amount of impurities contained in the extracts is controlled.Hot-dip method is used to measure the content of water-soluble extracts and alcohol-soluble extracts.The results show that the TLC results of qualitative identification take on obvious characteristics and strong specificity;water-soluble extract is no less than 72.69%;alcohol-soluble extract is no less than 75.95%;the inspecting limit of total ash is no more than 11.89%.The content measurement system for measuring the content of sipeimine in extracts of fritillaria tissue cultures is established.The regression equation is y=7.7591x+0.0437,R2=0.9991.The average recovery is 98.7541%,and the recovery RSD=1.3067%.The conclusion drawn in the paper is that qualitative identification and content determination method is simple,reproducible,and can effectively control the quality of the extracts of fritillaria tissue cultures.

Key words:TLC;extracts of fritillaria tissue cultures;sipeimine;quality standards

文章編號(hào)：1004-5422(2016)02-0124-04

收稿日期：2016-01-14.

基金項(xiàng)目：成都市經(jīng)濟(jì)和信息化委員會(huì)科研計(jì)劃(2012)資助項(xiàng)目.

作者簡(jiǎn)介：劉瑋(1976 — )， 男， 主管中藥師， 從事中成藥與保健品檢驗(yàn)研究.

中圖分類號(hào)：R284.2；S567.23+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A