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        丹參莖葉提取工藝研究

        2016-07-22 06:27:30徐騰達(dá)周蔚昕

        劉 濤, 焦 芳, 張 敏, 徐騰達(dá), 周蔚昕

        (成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院, 四川 成都 610106)

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        丹參莖葉提取工藝研究

        劉濤, 焦芳, 張敏, 徐騰達(dá), 周蔚昕

        (成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院, 四川 成都610106)

        摘要:目的:優(yōu)選丹參莖葉的提取工藝.方法:采用HPLC測(cè)定含量,流動(dòng)相甲醇—乙腈—甲酸—水(30∶10∶1∶59),檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm.以丹酚酸B和迷迭香酸提取量的綜合評(píng)分為指標(biāo),通過(guò)正交試驗(yàn)考察溶媒用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)丹參莖葉提取工藝的影響.結(jié)果:優(yōu)選的提取工藝為A2B3C2,即12倍量的20%乙醇,提取2次,每次1.5 h.結(jié)論:優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、合理,指標(biāo)成分提取率較高,可為丹參資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考.關(guān)鍵詞: 丹參莖葉;正交;丹酚酸B;迷迭香酸

        0引言

        中藥材丹參為唇形科植物丹參的干燥根及根莖,是中藥中應(yīng)用最早、最廣泛的藥物之一,具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消痛之功效[1],臨床常用于心血管疾病、急慢性肝炎等疾病的抗菌消炎[2].丹參根中主要含脂溶性的二萜醌類(lèi)和水溶性的酚酸類(lèi)成分.隨著臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,急需尋找新藥源.丹參傳統(tǒng)用藥部位為根和根莖,棄去莖葉部分,但現(xiàn)代藥理試驗(yàn)證明丹參莖葉的藥理作用與根、根莖相似,臨床療效也類(lèi)似[3-4].據(jù)統(tǒng)計(jì),丹參地上部分約占全植株的67%,藥源豐富,對(duì)于其開(kāi)發(fā)和利用意義重大.本課題選擇采收于四川中江縣的丹參莖葉為原藥材,參照文獻(xiàn)[5]的相關(guān)方法,對(duì)丹參莖葉提取工藝進(jìn)行了研究,為其生產(chǎn)和使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

        1儀器與試劑

        1.1試劑

        實(shí)驗(yàn)所用試劑包括:迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào),111871-201404)、丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào),111562-201212),購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所;丹參莖葉(批號(hào),20141203),采自中江石泉鄉(xiāng);乙腈、甲醇為色譜純,其余試劑為分析純,水為怡寶純凈水.

        1.2儀器

        實(shí)驗(yàn)所用儀器為:IChrom5100型高效液相色譜儀,大連依利特儀器有限公司生產(chǎn).

        2方法與結(jié)果

        2.1迷迭香酸、丹酚酸B含量測(cè)定

        2.1.1色譜條件.

        實(shí)驗(yàn)的色譜條件為:SinoChrom ODS-BP色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相,甲醇—乙腈—甲酸—水(30∶10∶1∶59),流速1.0 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm,進(jìn)樣量10 μL,柱溫為室溫.

        2.1.2對(duì)照品的制備.

        取迷迭香酸、丹酚酸B對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,置于棕色容量瓶中,加75%甲醇制成每1 mL含迷迭香酸0.0923 mg、丹酚酸B 0.0634 mg的混合對(duì)照品溶液.

        2.1.3供試品溶液的制備.

        取提取液適量,混勻,濾過(guò),作為供試品溶液備用.2.1.4線性關(guān)系考察.

        精密吸取迷迭香酸、丹酚酸B混合對(duì)照品溶液2、4、8、10、14、20 μL分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積.以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X進(jìn)行線性回歸,得迷迭香酸線性回歸方程,Y=181.44X-10.493,r=0.9999;丹酚酸B線性回歸方程,Y=59.180X+18.303,r=0.9993.結(jié)果表明,迷迭香酸與丹酚酸B分別在0.1846~1.18460 μg及0.1268~1.2680 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積成良好線性關(guān)系.

        2.1.5精密度試驗(yàn).

        精密吸取迷迭香酸、丹酚酸B混合對(duì)照品溶液10 μL,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,迷迭香酸、丹酚酸B峰面積RSD分別為0.80%和1.54%,表明精密度較好.

        2.1.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn).

        精密吸取同一供試品溶液10 μL,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件,分別于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,迷迭香酸、丹酚酸B峰面積RSD分別為0.51%和1.95%,表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定.

        2.1.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn).

        取同一批樣品,照“2.1.3”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液,平行6份,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積,并計(jì)算含量,迷迭香酸、丹酚酸B RSD分別為0.75%和1.93%,表明本方法重復(fù)性良好.

        2.1.8回收率實(shí)驗(yàn).

        取已知含量的丹參莖葉粉末6份,每份約1.0 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,分別精密加入迷迭香酸對(duì)照品4 mL(0.4792 mg/mL),丹酚酸B對(duì)照品2.3 mL(0.1273 mg/mL),按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,按“2.1.1”色譜條件測(cè)定其含量,計(jì)算平均加樣回收率,迷迭香酸、丹酚酸B分別為99.26%、96.45%,其RSD分別為3.52%、1.08%.表明本方法回收率良好.

        表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

        2.1.9原藥材含量測(cè)定.

        取樣品約2.0 g,精密稱(chēng)定,按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量,測(cè)定結(jié)果為,丹酚酸B含量為0.74%,迷迭香酸含量為1.66%.

        2.2丹參莖葉提取工藝研究

        2.2.1提取溶劑考察.

        取丹參莖葉粗粉5份,每份100 g,分別加入10倍量的60%乙醇、50%乙醇、40%乙醇、20%乙醇、水,提取2次,每次0.5 h,濾過(guò),濾液合并,作為供試品溶液備用.按照“2.1.1"項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其含量,結(jié)果如表2所示.

        表2 提取溶劑考察

        注:綜合評(píng)分=丹酚酸B的量*50%+迷迭香酸的量*50%

        由表2結(jié)果可見(jiàn),水提取綜合評(píng)分較低,所得的指標(biāo)成分含量明顯低于乙醇提取,而不同濃度乙醇提取效果相差也較大,經(jīng)加權(quán)評(píng)分計(jì)算,20%乙醇提取的加權(quán)評(píng)分值大于其他乙醇濃度提取,故選擇20%乙醇為提取溶劑.

        2.2.2正交試驗(yàn).

        參考已有的文獻(xiàn)資料數(shù)據(jù)和單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究選取提取次數(shù)(A)、提取時(shí)間(B)及溶媒倍量(C)為考察因素,以丹酚酸B和迷迭香酸含量的綜合評(píng)分為考察指標(biāo).取干燥丹參莖葉粗粉9份,每份100 g,按照 L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行正交試驗(yàn),因素水平見(jiàn)表3,結(jié)果見(jiàn)表4,方差分析見(jiàn)表5.

        表3 因素水平表

        表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

        注:綜合評(píng)分=丹酚酸B的量*50%+迷迭香酸的量*50%

        表5 方差分析表

        由直觀分析及方差分析可知,影響丹參莖葉提取工藝因素順序依次為C>B>A,其中,C對(duì)提取工藝有顯著影響,A、B無(wú)顯著影響.本研究最終確定提取工藝為,A2B3C2,即,12倍量20%乙醇,提取2次,每次1.5 h.

        2.2.3正交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).

        稱(chēng)取丹參莖葉粗粉3份,每份為100 g,分別加12倍量20%乙醇,提取2次,每次1.5 h,濾過(guò),濾液合并,搖勻,作為供試品溶液進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)結(jié)果得,丹酚酸B的量分別為0.528 g、0.441 g、0.529 g,迷迭香酸的量分別為0.923 g、0.947、1.005 g.結(jié)果表明,所選擇的工藝穩(wěn)定、可行.

        3討論

        丹參是我國(guó)使用最廣泛的中藥之一,傳統(tǒng)藥用部位為根和根莖,在采收時(shí)將莖葉部分去除.現(xiàn)代藥理試驗(yàn)證明其藥理作用與丹參根及根莖相似,且丹參莖葉的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于丹參根及根莖,因此,將其開(kāi)發(fā)利用可以擴(kuò)大藥材來(lái)源.本實(shí)驗(yàn)從溶媒種類(lèi)、溶媒倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素出發(fā),在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來(lái)研究丹參莖葉的提取工藝條件.最終篩選出提取工藝為,12倍量的20%乙醇提取2次,每次1.5h.此工藝條件下,丹酚酸B和迷迭香酸的得率分別為0.499%、0.958%.

        本研究還發(fā)現(xiàn),丹參莖葉采用回流提取法,工藝簡(jiǎn)單可行,且溶媒可以回收再利用,大大提高了實(shí)驗(yàn)可行性.迷迭香酸對(duì)熱穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)提取率較高,而丹酚酸B熱穩(wěn)定性較差[8],提取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng).

        參考文獻(xiàn):

        [1]肖禾,宋民憲,賴娟.國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中丹參的質(zhì)量控制情況[J].中國(guó)藥事,2006,20(1):57-59.

        [2]王新勝,吳艷芳,趙瑞娜.丹參地上部分活性成分TLC分析[J].海峽醫(yī)學(xué),2007,19(12):46-47.

        [3]倪學(xué)武,蘇靜.丹參地上部分有效成分的初步研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,1995,30(6):336-338.

        [4]齊永秀,曹明亮,萬(wàn)建建,等.高效液相色譜法測(cè)定白花丹參根、莖、葉中丹參素和原兒茶醛的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(12):1772.

        [5]王小平,劉峰,韓翠,等.丹參總酚酸提取工藝的優(yōu)化[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,33(2):32-38.

        [6]史國(guó)玉,劉艷輝,郭慶梅,等.丹參葉中水溶性成分提取工藝研究[J].山東中醫(yī)雜志,2012,31(2):132-134.

        [7]劉濤,羅小偉,梁悅,等.丹參莖葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].成都大學(xué)學(xué)報(bào),2015,34(3):231-233.

        [8]晉迎申.丹酚酸B熱穩(wěn)定性研究[J].上海醫(yī)藥,2014,35(21):78-80.

        Extraction Technology of Salvia Miltiorrhiza Stem and Leaf

        LIUTao,JIAOFang,ZHANGMin,XUTengda,ZHOUWeixin

        (School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

        Abstract:The paper is going to optimize the extraction process of Salvia Miltiorrhiza stem and leaf.HPLC is used to determine the content of mobile phase methanol-acetonitrile-formic acid water(30∶10∶1∶59),and the detection wavelength is 286 nm.By using the comprehensive score of salvianolic acid B and the extraction of rosmarinic acid content as the index,the effects of solvent dosage,extraction time and extraction frequency on the stems and leaves of Salvia Miltiorrhiza extraction process are tested through orthogonal test.The results show that the optimal extraction process is A2B3C2,that is,12 times of the amount of 20% ethanol,2 times of extraction with 1.5 h each time.The conclusion drawn in the paper is that the optimized extraction process is efficient and stable.The extraction rate of the index component is comparatively high.Therefore,the optimized extraction process can be used for reference for the development and utilization of Salvia Miltiorrhiza.

        Key words:Salvia Miltiorrhiza stem and leaf;orthogonal;salvianolic acid B;rosemarinic acid

        文章編號(hào):1004-5422(2016)02-0127-03

        收稿日期:2016-04-06.

        作者簡(jiǎn)介:劉濤(1976 — ), 男, 博士, 高級(jí)工程師, 從事中成藥新藥開(kāi)發(fā)與再評(píng)價(jià)研究.

        中圖分類(lèi)號(hào):R284.2;S567.5+3

        文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

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