聶忠莉， 郭兆元， 曾　吉， 王曉玲， 葉　丁， 張　勇， 郭　瑞

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都　610106；2.成都大學(xué) 四川抗生素工業(yè)研究所， 四川 成都　610106；3.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司， 四川 成都　610041)

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基于高效液相色譜法的帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體測(cè)定

聶忠莉1， 郭兆元2， 曾吉1， 王曉玲3， 葉丁3， 張勇3， 郭瑞3

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都610106；2.成都大學(xué) 四川抗生素工業(yè)研究所， 四川 成都610106；3.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司， 四川 成都610041)

摘要：建立以高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體的方法.以硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agela Technologies silica 4.6×250 mm，5 μm)；以正己烷—異丙醇(85∶15)為流動(dòng)相，流速，1.0 mL/min，柱溫，30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)，215 nm.實(shí)驗(yàn)表明，帕瑞昔布鈉與位置異構(gòu)體分離度為1.86，理論塔板數(shù)分別為8 041和8 929；在0.04 μg/mL～0.64 μg/mL范圍內(nèi)，帕瑞昔布鈉異構(gòu)體線性關(guān)系良好(A=70.647c-1.401，r=0.9998)；重復(fù)性良好(RSD為0.12%)；平均回收率為94.47%(RSD為3.03%，n=9).采用HPLC法測(cè)定帕瑞昔布鈉中的位置異構(gòu)體，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高且靈敏度好，可為控制帕瑞昔布鈉質(zhì)量提供依據(jù).

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；雜質(zhì)檢測(cè)；帕瑞昔布鈉；位置異構(gòu)體

0引言

帕瑞昔布鈉的化學(xué)名為N-[[4-(5-甲基-3-苯基-4-異惡唑基)苯基]磺酰基]丙酰胺鈉，分子式為C19H17N2O4SNa，分子量為392.41，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

圖1帕瑞昔布鈉化學(xué)結(jié)構(gòu)式

帕瑞昔布鈉是一種人工合成藥物[1]，其對(duì)骨科、外科、婦科等臨床各科患者術(shù)后鎮(zhèn)痛有良好的效果，副作用較小[2-6].帕瑞昔布鈉中位置異構(gòu)體是帕瑞昔布鈉的構(gòu)造異構(gòu)(位置異構(gòu))體，是本品合成第一步磺化過(guò)程中在苯環(huán)上產(chǎn)生的間位異構(gòu)，主要是苯環(huán)間位結(jié)構(gòu)化合物N-[3-(5-甲基-3-苯基-4-異惡唑基)苯基]磺酰胺，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2所示.由于官

圖2帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體化學(xué)結(jié)構(gòu)式

能團(tuán)位置的不同，其生物活性也可能不同，本研究參考《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄[7]，利用HPLC分析能將帕瑞昔布鈉與其位置異構(gòu)體進(jìn)行有效分離的檢測(cè)條件，并初步確定測(cè)定帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體的方法，通過(guò)對(duì)其他批次樣品中的位置異構(gòu)體含量的測(cè)定，進(jìn)而對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證.本方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高且靈敏度好，可為控制帕瑞昔布鈉質(zhì)量提供依據(jù).

1儀器與試藥

1.1儀器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：奧泰SSI-1500型高效液相色譜儀(美國(guó)，AIITECH)；UV-759CRT型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；BP-210D型電子分析天平(德國(guó)，Sartorius)；KH-5200E型超聲波清洗器(頻率40 kHz，超聲時(shí)長(zhǎng)15 min，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司).

1.2試藥

帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體對(duì)照品，成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司自制(批號(hào)，ZI130701)；帕瑞昔布鈉(研究用批號(hào)，130801，含量測(cè)定批號(hào)，130903、130904、130905、131101、131102、131103)；正己烷、異丙醇(Merk)，色譜純.

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：色譜柱，硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agela Technologies silica 4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相，正己烷—異丙醇(85∶15)；流速，1.0 mL/min；柱溫，30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，215 nm；進(jìn)樣量，10 μL.

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液.

取帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體對(duì)照品適量，加正己烷—異丙醇(50∶50)溶解并稀釋，制成每1 mL約含帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體0.8 μg的溶液，制得對(duì)照品溶液.

2.2.2供試品溶液.

取帕瑞昔布鈉適量，加正己烷—異丙醇(50∶50)溶解并稀釋制成每1 mL約含帕瑞昔布鈉0.4 mg的溶液，制得供試品溶液.

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)與專屬性實(shí)驗(yàn)

取帕瑞昔布鈉和帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體對(duì)照品各適量，加正己烷—異丙醇(50∶50)溶解并稀釋，制成每1 mL約含帕瑞昔布鈉0.4 mg和帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體0.8 μg的溶液.在“2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3帕瑞昔布鈉(B)及其異構(gòu)體(A)對(duì)照品溶液色譜圖

色譜圖顯示，帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體、帕瑞昔布鈉依次出峰，分離度為1.86，理論塔板數(shù)分別為8 929和8 041，并且空白溶劑無(wú)干擾，均符合檢測(cè)要求.

2.4線性實(shí)驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體對(duì)照品溶液0.5、2、4、6、8 mL，分別置于10 mL量瓶中，用正己烷—異丙醇(50∶50)定溶，制成系列對(duì)照品溶液，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL，以“2.1”項(xiàng)下條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖.以峰面積A為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度c為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為，A=70.647c-1.401，r=0.9998.表明其在0.04～0.64 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.5檢測(cè)限與定量限

取帕瑞昔布鈉異構(gòu)體對(duì)照品適量，加正己烷—異丙醇(50∶50)溶解并稀釋，制成一定濃度的溶液.在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖.若該色譜圖主峰峰高與空白基線相對(duì)應(yīng)位置的基線噪音比值較大，則逐級(jí)稀釋供試品溶液，直至比值為10∶1時(shí)，注入儀器的量為定量限；當(dāng)比值為3∶1時(shí)，注入儀器的量為檢測(cè)限.

根據(jù)信噪比為3∶1和10∶1時(shí)的供試品濃度和進(jìn)樣體積，計(jì)算出帕瑞昔布鈉異構(gòu)體的檢測(cè)限和定量限分別為，0.23 ng和0.52 ng.

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取帕瑞昔布鈉及帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體對(duì)照品適量，共6份，分別加正己烷—異丙醇(50∶50)制成約每毫升含帕瑞昔布鈉0.4 mg、帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體0.8 μg的供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖.計(jì)算帕瑞昔布鈉峰面積的RSD為1.20%，帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體峰面積的RSD為0.12%.結(jié)果表明，本方法進(jìn)樣重復(fù)性良好.

2.7溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL在“2.1”項(xiàng)條件下，于0、2、4、6、8、24、48 h時(shí)分別進(jìn)樣，記錄色譜圖.結(jié)果對(duì)照品溶液峰面積的RSD為3.29%，表明對(duì)照品溶液在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定.

精密量取“2.6”項(xiàng)下的1份供試品溶液10 μL在“2.1”項(xiàng)條件下，于0、2、4、6、8、24、48 h時(shí)分別進(jìn)樣，記錄色譜圖.結(jié)果供試品溶液中帕瑞昔布鈉峰面積的RSD為4.04%，帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體峰面積的RSD為0.68%，表明供試品溶液在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液9份，分別加入不同量對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(4.0 μg/mL)，并用正己烷—異丙醇(50∶50)溶解并稀釋成濃度為80%、100%、120%的供試品溶液各3份.在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖.按外標(biāo)法計(jì)算得平均回收率為94.47%、RSD為3.03%(n=9).

2.9耐用性實(shí)驗(yàn)

分別調(diào)整流動(dòng)相比例[(85+5)%正己烷]、流速[(1.0-0.4)mL/min]、波長(zhǎng)[(215±5)nm]、柱溫[(30±5)℃]和色譜柱(Phenomenex silica 4.6×250 mm，5 μm)，考察本法的耐用性.結(jié)果顯示，色譜條件在上述范圍內(nèi)的變化不影響測(cè)定結(jié)果.

2.10樣品中位置異構(gòu)體含量的測(cè)定

取6批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)配制成供試品溶液，分別取10 μL，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，檢測(cè)樣品中帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體，結(jié)果均未檢出，結(jié)果見(jiàn)圖3～圖5.

圖3空白溶液色譜圖

圖4對(duì)照品溶液色譜圖

圖5供試品溶液色譜圖

3討論

3.1波長(zhǎng)的選擇

取帕瑞昔布鈉與帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體適量，分別用乙腈—水(40∶60)配置成每1 mL含各物質(zhì)約0.02 mg的溶液，按照紫外—可見(jiàn)分光光度法[9]在200 nm～400 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明，帕瑞昔布鈉與帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體具有不同的紫外特征峰，最大吸收波長(zhǎng)略有差異，但均具有較大的紫外末端吸收，參考相關(guān)文獻(xiàn)，最終選擇波長(zhǎng)215 nm作為帕瑞昔布鈉中位置異構(gòu)體含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng).

3.2流動(dòng)相的選擇

由于帕瑞昔布鈉位置異構(gòu)體是帕瑞昔布鈉合成第一步磺化過(guò)程中在苯環(huán)上產(chǎn)生的間位異構(gòu)，兩者極性比較相近，采用有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)條件下的反相液相色譜法不能有效地分離，因此采用正相液相色譜法對(duì)本品的異構(gòu)體進(jìn)行分離和檢查.以正己烷—異丙醇為流動(dòng)相體系進(jìn)行流動(dòng)相的比例篩選.試驗(yàn)考察了正己烷—異丙醇(50∶50)、正己烷—異丙醇(75∶25)、正己烷—異丙醇(85∶15)等流動(dòng)相對(duì)帕瑞昔布鈉及位置異構(gòu)體的分離效果.結(jié)果顯示，以正己烷—異丙醇(85∶15)為流動(dòng)相時(shí)，帕瑞昔布鈉及位置異構(gòu)體的峰分離完全，且出峰時(shí)間適宜，專屬性強(qiáng).3.3樣品溶解溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了以乙腈—水(40∶60)、乙腈—水(47∶53)、正己烷—異丙醇(50∶50)、正己烷—異丙醇(75∶25)、正己烷—異丙醇(85∶15)作為樣品溶解溶劑.結(jié)果顯示，正己烷—異丙醇(50∶50)對(duì)帕瑞昔布鈉及位置異構(gòu)體的溶解性較好.

4結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法，以硅烷鍵合硅膠為填充劑和正己烷—異丙醇(85∶15)為流動(dòng)相，對(duì)帕瑞昔布鈉中的位置異構(gòu)體進(jìn)行了含量檢測(cè).結(jié)果說(shuō)明，本方法可有效的測(cè)定帕瑞昔布鈉的間位和對(duì)位異構(gòu)體，為帕瑞昔布鈉的實(shí)際生產(chǎn)提供了理論依據(jù).

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Determination of Positional Isomers in Parecoxib Sodium by NP-HPLC

NIEZhongli1,GUOZhaoyuan2,ZENGJi1,WANGXiaoling3,YEDing3，ZHANGYong3，GUORui3

(1.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China;2.Sichuan Industrial Institute of Autibiotics, Chengdu University, Chengdu 610106, China;3.Chengdu Climb Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Chengdu 610041, China)

Abstract:The paper is going to establish a high performance liquid chromalograph(HPLC) method for the determination of positional isomers in parecoxib sodium.Silane chemically bonded silica is used as bulking agent(Agela Technologies silica 4.6×250 mm，5 μm),with n-hexane-isopropanol(85∶15) as a mobile phase.The detection wavelength is set at 215 nm.The column temperature is 30 ℃ and the flow rate is 1.0 mL/min.The resolution between parecoxib and its positional isomers is 1.86 and the number of theoretical plates are 8 041 and 8 929.The positional isomers in parecoxib sodium shows a good linear relationship at a range of 0.04～0.64 μg/mL(r=0.9998) and also a good repeatability(RSD is 0.12%);the average recovery is 94.47%(RSD is 3.03%,n=9).The method is sensitive,accurate,and simple.Also,it can provide a basis for the quality control of parecoxib sodium.

Key words:HPLC method;impurity testing;parecoxib;positional isomers

文章編號(hào)：1004-5422(2016)02-0113-04

收稿日期：2016-05-18.

作者簡(jiǎn)介：聶忠莉(1966 — )， 女， 副主任藥師， 從事藥物制劑與分析研究.

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2；O657.72

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A