梁璐

河南省洛陽市第一中醫(yī)院藥劑科　471000

白芷飲片的薄層鑒別和指紋圖譜研究

梁璐

河南省洛陽市第一中醫(yī)院藥劑科471000

目的建立中藥飲片白芷的薄層色譜（TLC）和高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，進而對白芷飲片的真?zhèn)渭百|(zhì)量優(yōu)劣進行控制。方法利用薄層色譜方法，測定10批白芷樣品，以歐前胡素為對照品，用硅膠G薄層板，展開劑為石油醚（30～60℃）-乙醚（3∶2），于254 nm處檢視；同時利用高效液相色譜法，以YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-0.1甲酸水為流動相梯度洗脫，采用國家藥典委員會的中藥指紋圖譜相似度計算軟件對數(shù)據(jù)進行分析，并對方法進行了評價。結(jié)果10批不同產(chǎn)地的白芷飲片TLC特征圖譜有一個特征斑點，且斑點顯色清晰；經(jīng)HPLC指紋圖譜分析，確立了10個共有峰，根據(jù)指紋圖譜相似度評價結(jié)果得出10批樣品雖存在一定的差異，但其相似度仍基本達到0.8以上，具有較好的相關(guān)性。結(jié)論本方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，所建立的指紋圖譜為白芷飲片的產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

白芷；薄層；鑒別；高效液相色譜

［Abstract］Objective To estab1ish a specific TLC method and HPLC fingerprint for Ange1icae Dahuricae，a Chinese Herba1 Medicine，in order to contro1 its authenticity and qua1ity.Methods Thin 1ayer chromatography（TLC）method was used to measure 10 batches of Ange1icae Dahuricae samp1es，using Imperatorin as reference，with petro1eum ether （30-60℃）-ether（3∶2）as deve1oping agent in si1ica ge1 G p1ate，and the detection wave1ength was at 254 nm；The HPLC chromatographic separation was performed on a C18co1umn（YMC-Pack ODS-A，4.6 mm×250 mm，5μm），the mobi1e phase was a mixture of acetonitri1e-0.1%formic acid in gradient e1ution.The simi1arity software of Chinese medicine fingerprint of the State Pharmacopoeia Commission was adopted for the data ana1ysis and the method eva1uation.Results The TLC resu1ts of 10 batches of different origin of Ange1icae Dahuricae had one c1ear and accurate characteristic spot；10 common peaks were estab1ished by HPLC fingerprint ana1ysis，and according to the simi1arity eva1uation resu1ts，a1though there were some differences between the 10 batches of samp1es，the simi1arity was sti11 more than 0.8，which showed a good corre1ation.Conclusion This method is stab1e and good in reproducibi1ity.The fingerprint estab1ished can be used to identify the origin and qua1ity contro1 of Ange1icae Dahuricae.

［Key words］Ange1icae Dahuricae；TLC；Identification；HPLC

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica （Fisch.exHoffm.）Benth.etHook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根［1］。其性味溫、辛，主要功效是祛風(fēng)燥濕、消腫止痛［2］。白芷用于止痛已久，為我國40種大宗常用中藥材品種之一，占世界白芷產(chǎn)量的90%以上［3］，在中藥材商品中使用頻率很高。白芷的主要藥效成分為香豆素類成分［4-5］。現(xiàn)代藥理證明，白芷具有平喘鎮(zhèn)痛抗炎等作用［6-8］，故《中國藥典》將作為白芷定量的控制標(biāo)準。目前對白芷的質(zhì)量評價主要采用高效液相色譜法［9-10］。但白芷主產(chǎn)河北、河南、四川［11］，其受加工采收時間、炮制方法、儲存條件的影響，僅單一成分不能反映其飲片的質(zhì)量［12-15］。本文收集了10批白芷樣品，分別采用薄層色譜法和高效液相色譜法，對白芷的特征圖譜進行研究，通過圖譜的分析對白芷飲片的質(zhì)量評價及真?zhèn)舞b別提供了科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Shimadzu LC-20AB高液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機，自動進樣器Prominence SIL-20A，二極管陣列檢測器SPD-M20A和柱溫箱CTO-20A；色譜柱為YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）；CAMAG公司薄層色譜系統(tǒng)，包括半自動點樣儀1inomat5-15074及自動成像系統(tǒng)Visua1izer-151204；硅膠預(yù)制薄層板G（青島海洋化工廠）。

1.2藥品與試劑

甲酸、乙腈（色譜級，美國天地）；水（去離子水，自制）。歐前胡素（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號ZL1203036，純度99%）；白芷飲片共10批，產(chǎn)地（批號）依次為浙江（110821）、安徽（110516）、安徽（120216）、安徽（01201116）、四川（101001）、四川（111012）、四川（100409）、浙江（101212）、安徽（090806）、安徽（120106），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳德康教授鑒定為合格的白芷飲片，并將飲片密封保存于陰涼干燥處。

2　方法與結(jié)果

2.1TLC特征圖譜研究

2.1.1對照品溶液的制備

精密稱取歐前胡素對照品，加乙酸乙酯，制成0.1 mg/mL，作為對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備

精密稱取白芷粉末0.5 g，置于10 mL容量瓶中，加超聲提取乙醚10 mL，30 min時時振搖，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3TLC特征圖譜的建立

配制石油醚（30～60℃）-乙醚（3∶2）作為薄層展開劑，吸取“2.1.1”和“2.1.2”項下制備的溶液各4 μL，點于同一硅膠G薄層板上，展開，取出，晾干，放置30 min，置紫外光燈（254 nm）下檢視，得到白芷飲片TLC特征圖譜，其中6號樣點為對照品歐前胡素，1～5、7～11號樣點分別對應(yīng)10批白芷飲片樣品。見圖1。

圖1　白芷飲片TLC特征圖譜（254 nm）

2.2 HPLC指紋圖譜研究

2.2.1色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相：乙腈（A）-0.1甲酸水溶液（B）；色譜柱柱溫：40℃；體積流量：1 μL/min；進樣體積：10 μL；檢測波長：254 nm。

梯度洗脫程序：0～40 min，5%～10%B；40～80 min，10%～50%B；80～90 min，50%～65%B；90～100 min，65%～75%B；100～115 min，75%～95%B，115～120 min，95%～5%B。

2.2.2供試品溶液的制備

精密稱取白芷粉末1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加80%甲醇30 mL，超聲提取30 min，濾過，再超聲30 min，合并濾液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，再加80%甲醇定容到10 mL容量瓶。

2.2.3共有峰的標(biāo)定

白芷的指紋圖譜中含有10個色譜峰，選擇保留時間適中且分離度較好的8號峰（保留時間為89.40 min）作為參照峰。采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》軟件導(dǎo)入10批次白芷的HPLC圖譜數(shù)據(jù)，以平均數(shù)法生成對照指紋圖譜的共有模式［16］，見圖2。建立對照指紋圖譜，見圖3。

圖2　白芷飲片高效液相共有模式色譜圖

圖3　10批白芷飲片HPLC指紋圖譜

經(jīng)色譜分析，確立了10個共有峰（圖2）。根據(jù)指紋圖譜相似度評價結(jié)果得出各樣品的相似度，10批樣品來自四川、安徽、浙江等地，因此存在一定的差異，但其相似度仍達到0.8以上，具有很好的相關(guān)性，相似度計算數(shù)據(jù)見表1。

表1　樣品相似度

2.2.4方法學(xué)試驗

2.2.4.1精密度試驗分別精密稱取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6針，進樣體積10 μL，測定各圖譜共有峰相對保留時間的RSD＜2.52%，相對峰面積值的RSD ＜3.08%，符合指紋圖譜的要求。

2.2.4.2重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號白芷樣品6份，按上述方法制備供試品溶液，照上述色譜條件，分別進樣，進樣體積10 μL，采集其色譜圖，測定各圖譜共有峰相對保留時間的RSD＜2.56%，相對峰面積值的RSD＜2.81%，各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積均無明顯變化，表明該分析方法重現(xiàn)性良好。

2.2.4.3穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、24 h進樣，進樣體積10 μL，采集其色譜圖，測定各圖譜共有峰相對保留時間的RSD＜3.04%，相對峰面積值的RSD＜3.11%，各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積均無明顯變化，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4加樣回收試驗 精密稱取同一批號的白芷樣品5份，每份0.15 g，分別置于50 mL量瓶中，加入對照品2.5 mL，按上述方法制備供試品溶液，進樣10 μL［17-18］。結(jié)果顯示RSD值為0.67%。見表2。

表2　白芷歐前胡素的加樣回收試驗結(jié)果（n=5）

2.2.5共有峰的相對保留時間及相對峰面積值

各樣品的指紋圖譜共有峰相對保留時間及相對峰面積值數(shù)據(jù)見表3～4。所建立的白芷指紋圖譜的10個共有峰非常吻合，各批樣品之間相對保留時間RSD值較小，保留時間穩(wěn)定，無明顯差異。見表3。不同批次白芷樣品10個共有峰相對峰面積RSD值差異較大，由此可知各批次各成分的含量之間存在明顯差異。見表4。

表3　共有峰相對保留時間

表4　共有峰相對峰面積值

3　討論

3.1TLC鑒別

本文比較了甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚的超聲提取液的薄層色譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醚提取的供試品溶液斑點最多，且斑點顏色較深。試驗先后比較了石油醚（30～60℃）-乙醚-乙酸乙酯、石油醚（30～60℃）-乙醚［19］，經(jīng)反復(fù)實驗，選擇了石油醚（30～60℃）-乙醚（3∶2）為展開劑可獲得滿意的、重現(xiàn)性好的薄層色譜效果，歐前胡素Rf值為0.65。考察了不同溫濕度對色譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度在28℃以下，展開后的色譜斑點集中，邊緣效應(yīng)小，歐前胡素Rf值在0.47～0.62間。

3.2HPLC指紋圖譜

流動性的考察，經(jīng)過前期比較甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液后的色譜圖，最終確定選擇分離度較好，響應(yīng)值高的乙腈-0.1%甲酸水作為流動相［20-27］。

提取條件的優(yōu)化，經(jīng)過前期比較甲醇、乙醇、80%甲醇、60%甲醇、60%乙醇、純水作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)其最終的樣品色譜圖顯示，80%甲醇作為提取溶劑時，其色譜峰、分離度、基線最適宜。

白芷飲片含有多種有效成分，單一的測定一個或多個成分不足以評價其質(zhì)量，因此本研究通過建立全面又系統(tǒng)地反映化學(xué)成分的薄層色譜和指紋圖譜，全面地反映白芷的飲品質(zhì)量。

本實驗從白芷飲片整體色譜圖入手，選取了10個特征峰構(gòu)成了白芷的指紋圖譜，以共有模式作為白芷飲片的鑒別標(biāo)準，能提供更全面的質(zhì)量控制信息，可為白芷飲片及其制劑質(zhì)量標(biāo)準的擬定提供依據(jù)。

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TLC identification and HPLC fingerprint of Angelicae Dahuricae

LIANG Lu
Department of Pharmacy，the First Traditiona1 Chinese Medicine Hospita1 of Luoyang，He'nan Province，Luoyang 471000，China

R927

A

1673-7210（2016）04（c）-0139-04

國家火炬計劃項目（2010GH020663）；江蘇省科技支撐計劃工業(yè)項目（BE2011012）。

2016-01-04本文編輯：趙魯楓）