趙曉娟

南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇無(wú)錫　214002

蛇床子素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究

趙曉娟

南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇無(wú)錫214002

目的研究蛇床子素對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞的凋亡機(jī)制。方法HeLa細(xì)胞分別用不同濃度的蛇床子素處理。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期；Western b1ot檢測(cè)Bc1-2、Bax、caspase-3和caspase-9表達(dá)情況。結(jié)果蛇床子素濃度為20～120 μg/mL可以劑量和時(shí)間依賴性降低HeLa細(xì)胞的活力。Hoechst 33342染色顯示蛇床子素處理后的HeLa細(xì)胞膜通透性增高。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示蛇床子素作用HeLa細(xì)胞后可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，20、40、80 μg/mL蛇床子素處理后細(xì)胞凋亡率分別為（21.5±3.6）%、（45.8±5.4）%、（63.6±7.1）%，明顯高于0 μg/mL蛇床子素處理的（4.5±1.5）%（P＜0.05）。HeLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度蛇床子素（20、40、80 μg/mL）處理48 h后，G0/G1期細(xì)胞比例增加，同時(shí)G2/M期與S期細(xì)胞比例減少（P＜0.05）。Western b1ot檢測(cè)結(jié)果顯示蛇床子素（20、40、80 μg/mL）處理HeLa細(xì)胞中C1e-caspase-3、C1ecaspase-9和Bax表達(dá)量升高，而B(niǎo)c1-2表達(dá)量降低，且呈劑量依賴性。結(jié)論蛇床子素能抑制HeLa細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制與下調(diào)Bc1-2基因的表達(dá)、上調(diào)Bax基因的表達(dá)及增加caspase活性有關(guān)。

蛇床子素；宮頸癌；HeLa細(xì)胞；Bcl-2家族蛋白

［Abstract］Objective To exp1ore apoptosis mechanism of ostho1e on human cervica1 cancer HeLa ce11s.

Methods HeLa ce11s were treated with ostho1e in different concentration.Re1ative ce11 viabi1ities were determined by the MTT method；Hoechst 33342 staining was used to observe the morpho1ogica1 changes of ce11s；apoptosis and ce11 cyc1e were ana1yzed by f1ow cytometry；the protein expression 1eve1s of Bc1-2，Bax，caspase-3 and caspase-9 were detected by Western b1ot.Results Ostho1e（20-120 μg/mL）significant1y inhibited the viabi1ities of HeLa ce11s in a doseand time-dependent manner.Hoechst 33342 staining showed that the membrane permeabi1ity of ostho1e treated HeLa ce11s increased.F1ow cytometry resu1t showed that ostho1e cou1d induce apoptosis in HeLa ce11s，ce11 apoptotic rate of 20，40，80 μg/mL ostho1e processing was（21.5±3.6）%，（45.8±5.4）%，（63.6±7.1）%respective1y，significant1y higher than that of 0 μg/mL ostho1e processing［（4.5±1.5）%］（P＜0.05）.After different concentrations of ostho1e（20，40，80 μg/mL）processing for 48 h，the proportion of HeLa ce11s in G0/G1phase increased，whi1e the proportion of the G2/M phase and S phase reduced（P＜0.05）.Western b1ot showed that ostho1e（20，40，80 μg/mL）up-regu1ated the expression 1eve1s of C1e-caspase-3，C1e-caspase-9 and Bax，but down-regu1ated Bc1-2，in a dose-dependent manner.Conclusion Ostho1e can inhibit the pro1iferation of HeLa ce11s and promote apoptosis，which may be associated with the down regu1ation of Bc1-2 expression and up regu1ation of Bax expression，as we11 as the increase of re1ative activity of caspase.

［Key words］Ostho1e；Cervica1 cancer；HeLa ce11s；Bc1-2 fami1y protein

宮頸癌是最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其死亡率占各類婦科腫瘤的首位［1］。現(xiàn)有化學(xué)藥品對(duì)其的臨床療效并不理想［2］，因此從天然產(chǎn)物中尋找抗癌活性成分是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)［3］。蛇床子素是中藥蛇床子的主要活性成分之一，具有廣泛的藥理活性，包括抗心律失常、解痙、降血壓、增強(qiáng)兔疫功能及廣譜抗菌作用等［4］。雖然蛇床子素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用曾有文獻(xiàn)報(bào)道，但其作用機(jī)制并未闡明。本研究旨在明確蛇床子素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞活力、凋亡及Bc1-2家族蛋白表達(dá)的影響，為揭示蛇床子素的抗腫瘤活性、作用機(jī)制以及臨床應(yīng)用前景提供扎實(shí)的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

蛇床子素購(gòu)于Sigma公司；人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞、噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒、Bc1-2、Bax抗體購(gòu)于上海哈靈生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)于Invitrogen公司；RPMI1640培養(yǎng)液、AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒購(gòu)自上海元龍生物技術(shù)有限公司；Hoechst 33342核酸染料購(gòu)自北京泛博生化有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司；其他試劑購(gòu)于北京試劑廠。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)液為含100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的PMI1640。培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2，濕度飽和。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取1×105/mL的HeLa細(xì)胞，接種于96孔板（200 μL/孔），至細(xì)胞貼壁后每孔加入終濃度為0、20、40、80、100、120 μg/mL的蛇床子素（樣品溶解于DMSO）。各濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以同體積PMI1640培養(yǎng)液為空白對(duì)照。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.3Hoechst 33342染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 HeLa細(xì)胞以1×105/mL的濃度接種于96孔板（200 μL/孔），細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為0、20、40、80 μg/mL的蛇床子素，培養(yǎng)HeLa細(xì)胞48 h后，PBS清洗1次，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS清洗2次，加入1 mmo1/L Hoechst 33342室溫染色15 min，封片，置于熒光顯微鏡下，選用340 nm的激發(fā)光觀察。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期 HeLa細(xì)胞以1×106/mL濃度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后加入終濃度分別為0、20、40、80 μg/mL的蛇床子素培養(yǎng)48 h，細(xì)胞離心固定后加入Annexin V-FITC和PI，篩網(wǎng)過(guò)濾后送流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的檢測(cè)。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量的變化 HeLa細(xì)胞以1×106/mL濃度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后分別加入蛇床子素，終濃度分別為0、20、40、80 μg/mL，處理48 h后收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書的方法抽提細(xì)胞漿總蛋白并測(cè)定濃度。抽提的蛋白樣品按常規(guī)方法做Western b1ot分析，檢測(cè)Bc1-2/Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1蛇床子素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

不同濃度蛇床子素處理48 h后，均測(cè)定細(xì)胞活力。如圖1所示，蛇床子素在濃度20～120 μg/mL范圍內(nèi)均可顯著抑制HeLa細(xì)胞活力，且表現(xiàn)出劑量依賴性。

圖1　不同濃度蛇床子素處理對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

2.2蛇床子素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33342核酸染料是一種細(xì)胞通透性細(xì)胞核復(fù)染劑，可被活細(xì)胞攝取，在與dsDNA結(jié)合后激發(fā)藍(lán)色熒光。Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，不同濃度蛇床子素處理組的HeLa細(xì)胞核濃縮聚集、碎裂，并發(fā)出較強(qiáng)的藍(lán)色熒光（圖2）。

圖2　不同濃度蛇床子素處理對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響（Hoechst 33342染色，200×）

流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明蛇床子素能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。如圖3所示，20、40、80 μg/mL蛇床子素處理HeLa細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為（21.5±3.6）%、（45.8±5.4）%、（63.6±7.1）%，明顯高于0 μg/mL蛇床子素的（4.5±1.5）%（P＜0.05），且其作用具有明顯劑量依賴性。

2.3蛇床子素對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響

HeLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度蛇床子素（20、40、80μg/mL）處理48 h后，G0/G1期細(xì)胞比例增加，同時(shí)G2/M期與S期細(xì)胞比例減少，說(shuō)明蛇床子素使HeLa細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，正常的細(xì)胞增殖周期被抑制。見(jiàn)表1。

表1　不同濃度蛇床子素處理后HeLa細(xì)胞周期變化（%）

2.4蛇床子素對(duì)HeLa細(xì)胞Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9表達(dá)量的影響

圖4所示，蛇床子素處理HeLa細(xì)胞48 h后，隨著蛇床子素濃度的升高，Bax的表達(dá)量依次升高，而B(niǎo)c1-2的表達(dá)量降低；未使用蛇床子素處理的HeLa細(xì)胞C1e-caspase-3、C1e-caspase-9幾乎沒(méi)有表達(dá)，而經(jīng)過(guò)蛇床子素（20、40、80 μg/mL）處理48h后，HeLa細(xì)胞C1e-caspase-3、C1e-caspase-9表達(dá)量呈濃度依賴性增加。

圖3　流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC和PI雙染色顯示蛇床子素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

圖4　蛇床子素對(duì)HeLa細(xì)胞Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9表達(dá)量的影響

3　討論

中醫(yī)藥除了有取材方便、價(jià)格低廉和毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)外，在減輕臨床癥狀、提高生存質(zhì)量、防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)生存期、提高兔疫力、增強(qiáng)放化療敏感性、減輕放化療不良反應(yīng)等方面均具有優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)中藥及其有效部位或成分抗癌研究工作取得了一系列的成果。對(duì)蛇床子中化學(xué)成分研究主要集中在香豆素類化合物上，如蛇床子素、佛手柑內(nèi)酯、異虎耳草素、花椒毒酚、花椒毒素、歐芹屬素乙等。其中蛇床子素又名甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚，是天然香豆素類化合物，是蛇床子中含量最大的化合物。蛇床子素具有廣泛的藥理活性，如對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜作用；對(duì)心血管系統(tǒng)具有抗心律失常作用、擴(kuò)張血管作用等；對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)具有拮抗激素引起的骨質(zhì)疏松作用等。此外，蛇床子素還具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肝損傷、抗氧化、抗衰老等作用［5-6］。

蛇床子素的體外抗腫瘤活性研究在國(guó)外報(bào)道較早，20世紀(jì)90年代有學(xué)者首先報(bào)道了蛇床子素通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶進(jìn)而表現(xiàn)出抗癌活性；有學(xué)者還報(bào)道了蛇床子素對(duì)胃腺癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞有明顯的抑制活性［7-11］。近年來(lái)，又有學(xué)者陸續(xù)報(bào)道了蛇床子素可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及肺癌細(xì)胞凋亡［12-15］。但是蛇床子素對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的具體機(jī)制尚不清楚。

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要自我調(diào)節(jié)機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是評(píng)估抗癌藥物效力的重要指標(biāo)之一［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素在20～120 μg/mL濃度范圍均能抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，量效關(guān)系及時(shí)效關(guān)系明顯。蛇床子素處理HeLa細(xì)胞48 h后可誘導(dǎo)凋亡，且量效關(guān)系明顯。

caspase家族蛋白的激活被公認(rèn)為是誘發(fā)凋亡的直接效應(yīng)物。本研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素呈濃度依賴性增加HeLa細(xì)胞中caspase-3和caspase-9的活性形式C1e-caspase-3和C1e-caspase-9的表達(dá)量，提示蛇床子素可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞caspase活性來(lái)抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Bc1-2蛋白家族是一個(gè)特殊的蛋白家族，其中有一些可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如Bad、Bid、Bax，有些則可以阻止細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，如Bc1-2、Bc1-w。Bc1-2能夠阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡。Bc1-2是一種內(nèi)膜蛋白，主要存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上，它在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，能通過(guò)增強(qiáng)線粒體膜電位，抑制鈣離子釋放，阻止核酸內(nèi)切酶活化，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用；Bax的作用與Bc1-2相反，可直接激活細(xì)胞凋亡效應(yīng)因子caspase或改變細(xì)胞膜通透性引起細(xì)胞色素C釋放某些離子和小分子通過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞Bc1-2和Bax比例改變可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bc1-2占優(yōu)勢(shì)時(shí)，細(xì)胞具有抗凋亡作用；相反，當(dāng)Bax過(guò)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞易發(fā)生凋亡［18-20］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)蛇床子素處理48 h后，抗凋亡蛋白Bc1-2表達(dá)下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，因此Bc1-2與Bax的比值增加，這與蛇床子素的凋亡作用呈正相關(guān)。這說(shuō)明蛇床子素作用于腫瘤細(xì)胞后，通過(guò)調(diào)控Bc1-2家族蛋白而引起促凋亡蛋白表達(dá)量上調(diào)，抗凋亡蛋白表達(dá)量下調(diào)，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。由于蛇床子素具有廣泛的生物學(xué)作用，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用可能并非針對(duì)單一靶點(diǎn)，因此對(duì)蛇床子素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡機(jī)制的進(jìn)一步研究以及阻滯細(xì)胞傳導(dǎo)通路、信使的相關(guān)研究，將對(duì)其臨床應(yīng)用具有較好的指導(dǎo)意義。

綜上所述，蛇床子素能抑制HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，量效關(guān)系明顯，作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)Bax蛋白表達(dá)并下調(diào)Bc1-2蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞caspase-3和caspase-9活性。本研究為宮頸癌治療先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了新的線索。

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Study on effect mechanism of HeLa cells apoptosis induced by osthole

ZHAO Xiaojuan
Department of Gynaeco1ogy and Obstetrics，Wuxi No.2 Peop1e's Hospita1 Affi1iated to Nanjing Medicia1 University，Jiangsu Province，Wuxi214002，China

R737.33

A

1673-7210（2016）04（c）-0032-04

2016-01-19本文編輯：李亞聰）