楊雪峰，勾文峰，趙爽，申道福，吳亞州，李君君，鄭華川

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)中心，腫瘤基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，遼寧 錦州 121001）

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·論著·

ING5基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的研究

楊雪峰，勾文峰，趙爽，申道福，吳亞州，李君君，鄭華川

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)中心，腫瘤基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，遼寧 錦州 121001）

摘要目的探討ING5基因表達(dá)對(duì)胃癌生長(zhǎng)抑制作用。方法構(gòu)建pEGFP?N1?ING5重組質(zhì)粒，獲得ING5高表達(dá)SGC?7901細(xì)胞株，分別通過(guò)CCK?8、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕、transwell、real?time PCR、Western blot、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)、免疫組化檢測(cè)并比較SGC?7901細(xì)胞與克隆細(xì)胞增殖率、周期與凋亡、遷移與侵襲、mRNA、裸鼠成瘤大小以及相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果與SGC?7901組及Mock組比較，轉(zhuǎn)染pEGFP?N1?ING5后，胃癌SGC?7901細(xì)胞增殖顯著抑制（P＜0.05），凋亡減少（P＜0.05），G1期比例增加，G2期比例下降（P＜0.05），遷移與侵襲能力減弱（P＜0.05），NF?κB、PI3K、p?Akt1/2/3、Bcl?2、XIAP、β?catenin、c?mycmRNA及蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；Akt1/2/3、MMP9mRNA及蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論ING5基因表達(dá)降低胃癌SGC?7901細(xì)胞株增殖、減少凋亡、發(fā)生G1期阻滯、抑制其遷移與侵襲、有效調(diào)控增殖、周期、黏附相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)，從而抑制胃癌的演進(jìn)與發(fā)展。

關(guān)鍵詞胃癌；ING5；腫瘤發(fā)生；基因治療

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胃癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，抑癌基因功能的失活或降低在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1］。生長(zhǎng)抑制基因家族（inhibitor of growth family member，ING）包括5個(gè)家族成員。其中，ING5定位于人染色體2q37.3上，因其具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并以p53蛋白依賴(lài)方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用，被認(rèn)為是一種抑癌基因［2］。研究［3］表明，ING5過(guò)表達(dá)可以通過(guò)調(diào)節(jié)p53誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究［4］發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌中ING5發(fā)生突變，其mRNA表達(dá)降低，揭示其腫瘤抑制作用。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織芯片研究［5］提示ING5由核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)可能是其致癌性與腫瘤演進(jìn)的關(guān)鍵因素，ING5由核入細(xì)胞質(zhì)后可能通過(guò)與p38MAPK和ME?KK4蛋白相互作用，從而參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)與DNA損傷。XING等［6］對(duì)于胃癌組織中ING5的分布與表達(dá)研究顯示，胃癌中ING5mRNA表達(dá)增加，細(xì)胞核ING5蛋白含量低于細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞核ING5表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤侵潤(rùn)與轉(zhuǎn)移、臨床病理分期呈負(fù)相關(guān)，而細(xì)胞質(zhì)ING5表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤侵潤(rùn)與轉(zhuǎn)移、臨床病理分期呈正相關(guān)，說(shuō)明ING5的定位對(duì)于胃癌的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建pEGFP?N1?ING5重組質(zhì)粒，獲得ING5高表達(dá)SGC?7901細(xì)胞株，進(jìn)而探討ING5基因在胃癌SGC?7901細(xì)胞中的分子生物學(xué)功能。通過(guò)裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，探討ING5基因與胃癌發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系，從而為胃癌發(fā)病的分子機(jī)制與靶基因治療提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒構(gòu)建

pCDNA3.1?ING5質(zhì)粒由C?té教授惠贈(zèng)［Laval University Cancer Research Center，H?tel?Dieu de Québec（CHUQ），Québec City，Québec G1R 2J6，Can?ada］，與載體（pEGFP?N1）進(jìn)行雙酶切，酶切位點(diǎn)為BamHⅠ和HindⅢ，構(gòu)建pEGFP?N1?ING5重組質(zhì)粒。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞系SGC?7901購(gòu)自中國(guó)北京癌癥研究所，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入青霉素（100 mg/L）和鏈霉素（100 mg/L），細(xì)胞在飽和濕度、37℃、5%CO2濃度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取狀態(tài)良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3轉(zhuǎn)染

SGC?7901細(xì)胞鋪盤(pán)貼壁24 h后，轉(zhuǎn)染pEGFP?N1?ING5質(zhì)粒與pEGFP?N1空載體質(zhì)粒，通過(guò)G418篩選單克隆細(xì)胞株，real?time PCR和Western blot鑒定ING5表達(dá)量，取ING5高表達(dá)克隆株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞增殖分析

SGC?7901與克隆株按2×104/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，選取0、24、48、72、96 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別加入10 μL CCK?8，培養(yǎng)箱孵育3 h后450 nm檢測(cè)吸光度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、增殖率為縱坐標(biāo)繪制增殖曲線(xiàn)。

1.5細(xì)胞周期分析

SGC?7901與克隆株按2×105/mL密度接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，收集細(xì)胞棄去上清，PBS沖洗2次，加入1 mL預(yù)冷75%乙醇，-20℃過(guò)夜，加入RNase（0.25 mg/mL），37℃孵育30 min，加入PI至終濃度50 μg/mL，4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6細(xì)胞凋亡分析

SGC?7901與克隆按2×105/mL密度接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，收集細(xì)胞以及上清液，PBS沖洗2次，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)加入7?AAD和PE?labeled an?nexin V（BD Pharmingen，USA）染料，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將SGC?7901與克隆株按1×106/mL接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，用200 μL槍頭劃去單層細(xì)胞，PBS清洗2次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，選取0、24、48、72 h拍照，使用圖像分析軟件測(cè)量細(xì)胞遷移率。

1.8細(xì)胞遷移與侵襲分析

SGC?7901細(xì)胞消化后無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，按2.5×105/mL密度接種于transwell小室（BD Biosci?ence）上層，下室加入含10%FBS培養(yǎng)基，侵襲實(shí)驗(yàn)還需在上室預(yù)先加入基質(zhì)膠孵育4 h后接種細(xì)胞懸液。24 h后PBS清洗transwell小室，100%甲醇固定細(xì)胞，吉姆薩染色，鏡下隨機(jī)選取視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.9RT?PCR

提取細(xì)胞總RNA，按QIAGEN RNeasy mini kit（德國(guó)QIAGEN公司）說(shuō)明書(shū)操作，逆轉(zhuǎn)錄酶avian myeloblastosis virus（AMV）和隨機(jī)引物購(gòu)自日本Ta?KaRa公司，real?time PCR使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡkit（日本TaKaRa公司），引物序列、循環(huán)數(shù)、產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

1.10Western blot

所有抗體購(gòu)于美國(guó)Santa cruz公司。提取各組細(xì)胞總蛋白并測(cè)定濃度。將各組蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)2 h后5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，加入適量一抗，4℃反應(yīng)過(guò)夜。二抗采用HRP標(biāo)記的IgG，室溫反應(yīng)1 h，ECL?Plus試劑盒（Santa Cruz公司）發(fā)光顯影檢測(cè)目的蛋白。

1.11裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

胰酶消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS洗滌2次后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1× 106/mL，用1 mL注射器抽取上述細(xì)胞懸液200 μL，皮下接種于6～8周的BALB/C裸鼠腋下，每隔3 d觀察裸鼠精神、飲食、體質(zhì)量以及腫瘤生長(zhǎng)情況。2～3周后用卡尺測(cè)量瘤體大小，腫瘤體積按長(zhǎng)×寬×高× 0.52計(jì)算。處死裸鼠，分離皮下腫瘤，稱(chēng)取腫瘤重量，分析各組間腫瘤大小差異。取部分腫瘤4%甲醛固定，石蠟包埋，制備切片用于后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)。

表1　Real-time PCR引物Tab.1　The primer of real-time PCR

1.12免疫組化

制作病理切片，切片經(jīng)過(guò)脫蠟、脫苯、抗原修復(fù)后，3%過(guò)氧化氫去掉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5%BSA室溫封閉，加入適量一抗4℃過(guò)夜。TBST清洗后加入二抗室溫孵育1 h，TBST清洗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染。切片梯度乙醇脫水后二甲苯透明，樹(shù)脂封片鏡下觀察拍照。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1ING5過(guò)表達(dá)對(duì)SGC?7901細(xì)胞惡性表型的影響

利用real?time PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染pEGFP?N1?ING5后單克隆中ING5的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后clone4和clone8中ING5mRNA和蛋白表達(dá)水平均增加（P＜0.05），見(jiàn)圖1。通過(guò)CCK?8檢測(cè)轉(zhuǎn)染pEGFP?N1?ING5后胃癌細(xì)胞SGC?7901增殖的影響，結(jié)果顯示與SGC?7901相比，ING5高表達(dá)克隆株可以有效抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05，圖2A）。應(yīng)用PI細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒與Annexin V/7?AAD凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染pEGFP?N1?ING5后對(duì)胃癌細(xì)胞SGC?7901周期凋亡的影響。結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染pEGFP ?N1?ING5后胃癌細(xì)胞SGC?7901發(fā)生G1期阻滯，細(xì)胞凋亡減少（P＜0.05，圖2B、2C）。

通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)與transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染pEGFP?N1?ING5后細(xì)胞遷移、侵襲能力，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP?N1?ING5后胃癌SGC?7901細(xì)胞遷移和侵襲能力均下降（P＜0.05，圖3A、3B）。

圖1　ING5轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞單克隆篩選Fig.1　Screening of monoclonal ING5 transfectants

圖2　ING5過(guò)表達(dá)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、周期與凋亡的影響Fig.2　The effect of ING5 expression on proliferation，cell cycle and apoptosis of SGC-7901 cells

Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP?N1?ING5后胃癌SGC?7901細(xì)胞NF?κB、PI3K、p?Akt1/2/3、Bcl?2、XIAP、β?catenin、c?myc、mRNA及蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）；Akt1/2/3、MMP9mRNA及蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4 A、4B。

2.2ING5過(guò)表達(dá)對(duì)裸鼠成瘤的影響

皮下注射胃癌細(xì)胞SGC?7901與轉(zhuǎn)染細(xì)胞株clone 8，分離皮下腫瘤，測(cè)定瘤體大小與體積，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP?N1?ING5后胃癌SGC?7901細(xì)胞裸鼠成瘤能力減弱，SGC?7901組平均瘤體大小為（434.35±13.02）mm3，clone 8組平均瘤體大小為（22.56±6.72）mm3，顯著抑制了瘤體大小（P＜0.05）。免疫組化ki67與TUNEL結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP?N1?ING5后胃癌SGC?7901細(xì)胞瘤體增殖降低，凋亡減少（圖5）。

3　討論

ING基因家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，它們廣泛參與負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、周期阻滯、并抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［7］。在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)ING5蛋白功能喪失，氨基酸突變或者定位的改變［8］。研究［3］表明，ING5可促進(jìn)p53的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)p21WAF1、Bax等下游靶基因，從而抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、發(fā)生周期阻滯。趙春陽(yáng)等［9］檢測(cè)到食管鱗狀細(xì)胞癌組織ING5mRNA表達(dá)下調(diào)，可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。路美玲等［10］發(fā)現(xiàn)在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中ING5mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，揭示其在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到抑制作用。

本研究結(jié)果表明，ING5過(guò)表達(dá)可以上調(diào)PI3K mRNA以及蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控其下游Akt1/2/3轉(zhuǎn)化為磷酸化激活狀態(tài)，然而ING5過(guò)表達(dá)可以活化NF?κB的表達(dá)，上調(diào)Bcl?2、XIAP進(jìn)而抑制胃癌SGC?7901細(xì)胞凋亡，不利于抗腫瘤藥物的治療，這也可能是其耐藥性的作用機(jī)制。此外，原癌基因c?myc表達(dá)升高，可能是ING5過(guò)表達(dá)調(diào)控SGC?7901細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制。β?cateninmRNA以及蛋白的表達(dá)升高，提示ING5可能通過(guò)調(diào)節(jié)β?catenin進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞間黏附，下調(diào)胃癌SGC?7901細(xì)胞MMP9蛋白表達(dá)從而抑制胃癌細(xì)胞遷移與侵襲。體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，ING5表達(dá)可以有效抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤形成，抑制其增殖，同樣抑制其凋亡，這與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明ING5作為抑癌基因的雙面性。

圖3　ING5過(guò)表達(dá)對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移與侵襲的影響Fig.3　The effect of ING5 expression on migration and invasion of SGC-7901 cells

綜上所述，抑癌基因ING5可以降低胃癌SGC?7901細(xì)胞株增殖、減少凋亡、發(fā)生G1期阻滯、抑制其遷移與侵襲、有效調(diào)控增殖、周期、黏附相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)，從而抑制胃癌的演進(jìn)與發(fā)展。但其抑制腫瘤細(xì)胞凋亡不利于抗腫瘤藥物的治療，將為抑癌基因ING5與胃癌化療之間建立聯(lián)系，為我們更全面了解胃癌發(fā)病的分子機(jī)制與靶基因治療提供新的思路與方向。

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圖4　ING5過(guò)表達(dá)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡、黏附相關(guān)基因mRNA以及蛋白表達(dá)的影響Fig.4　The effect of ING5 mRNA and protein expression of SGC-7901 cells

圖5　ING5過(guò)表達(dá)對(duì)SGC-7901細(xì)胞腫瘤異種移植模型增殖、凋亡的影響 ×200Fig.5　The effect of ING5 expression on SGC-7901 cells in xenograft and tumor proliferation and apoptosis×200

（編輯武玉欣）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

中圖分類(lèi)號(hào)R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)0258-4646（2016）07-0577-06

DOI：10.12007/j.issn.0258?4646.2016.07.001

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81172371；81472544）；遼寧省教育廳科學(xué)研究基金（LJQ2014093）；錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院校長(zhǎng)基金（XZJJ20140201；XZJJ20140203）

作者簡(jiǎn)介：楊雪峰（1988-），男，技師，碩士.

通信作者：鄭華川，E-mail：zhenghuachuan@hotmail.com

收稿日期：2015-05-16

Anti?tumor Effects of ING5Gene on Gastric Cancer

YANG Xuefeng，GOU Wenfeng，ZHAO Shuang，SHEN Daofu，WU Yazhou，LI Junjun，ZHENG Huachuan
（Cancer Research Central Laboratory，Tumor Basicand Translational Laboratory，Laboratorial Animal Center，The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical Universi?ty，Jinzhou121001，China）

AbstractObjective To study the effect ofING5 gene on growth inhibition of gastric cancer. Methods ING5 expressing plasmid was transfect?ed into SGC?7901 cells. The cell viability was assessed by CCK?8，cell apoptosis and cycle was detected by flow cytometry analysis，the migration and invasion was evaluated by scratch and transwell，the expressions of mRNA and protein were determined by real?time quantitative PCR and West?ern blot respectively. Nude mice were implanted subcutaneously with SGC?7901 cells and tumor size and related protein were analyzed. Results After transfection of pEGFP?N1?ING5，the proliferation of gastric cancer SGC?7901 cells was significantly inhibited（P ＜ 0.05），the apoptosis was decreased（P ＜ 0.05），the percentage of G1 phase was increased and G2 phase was decreased（P ＜ 0.05），the ability of migration and invasion was reduced（P ＜ 0.05），the expression ofNF?κB，PI3K，p?Akt1/2/3，Bcl?2，XIAP，β?catenin，c?myc mRNA，and protein levels were significantly in?creased（P ＜ 0.05），and the expression ofAkt1/2/3、MMP9 mRNA and protein levels were significantly decreased（P ＜ 0.05）. Conclusion The ING5 gene inhibits the SGC?7901 cell proliferation，induces G1 arrest，inhibits the migration and invasion，and effectively regulates the related genes and proteins about cell proliferation，cell cycle and adhesion，but reduces apoptosis.ING5 can inhibit the evolution and development of gastric can?cer.

Keywordsgastric cancer；ING5；tumorgenesis；gene therapy