史潔茹，田成俊，曾　強(qiáng)，郭相杰，路　健，高彩榮（.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理教研室，山西 太原 03000；.盂縣公安局，山西 陽泉 04500）

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·論著·

過敏性和冠心病猝死者心肌組織中肥大細(xì)胞類胰蛋白酶、腦利鈉肽的表達(dá)

史潔茹1，田成俊2，曾強(qiáng)1，郭相杰1，路健1，高彩榮1
（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理教研室，山西 太原 030001；2.盂縣公安局，山西 陽泉 045100）

摘要：目的 探討肥大細(xì)胞類胰蛋白酶、腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）在過敏性猝死和冠心病猝死鑒別診斷中的意義。方法 選取山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)病理學(xué)教研室2010—2015年尸檢案例心肌標(biāo)本共30例，分為顱腦損傷致死組、過敏性猝死組、冠心病猝死組，每組各10例。采用免疫熒光染色和Western印跡法分析各組心肌組織肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和BNP的表達(dá)。結(jié)果 過敏性猝死組、冠心病猝死組心肌組織內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶免疫熒光染色均出現(xiàn)陽性染色；三組間兩兩比較，表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。冠心病猝死組心肌組織內(nèi)BNP的表達(dá)量高于過敏性猝死組、顱腦損傷致死組（P＜0.05），過敏性猝死組與顱腦損傷致死組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 聯(lián)合檢測心肌組織內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶、BNP有望為過敏性猝死和冠心病猝死的法醫(yī)學(xué)鑒別診斷提供幫助。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)病理學(xué)；猝死；過敏反應(yīng)；冠狀動脈硬化；肥大細(xì)胞；類胰蛋白酶類；利鈉肽，腦

鑒別診斷過敏性猝死與冠心病猝死是法醫(yī)學(xué)實踐中常見任務(wù)之一，特別是在使用藥物或輸液過程中發(fā)生的猝死案例，冠心病常常會作為基礎(chǔ)病變參與過敏性休克的死亡過程，然而由于過敏性猝死病程短暫，缺乏特異性的病理改變，給兩者的鑒別診斷帶來一定困難。有研究［1-2］發(fā)現(xiàn)，過敏性疾病患者體內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶含量較正常人群高，有助于診斷過敏性疾病。但也有研究［3］發(fā)現(xiàn)，冠心病時體內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶含量也升高。因此單獨(dú)應(yīng)用肥大細(xì)胞類胰蛋白酶來鑒別兩者尚缺乏說服力，還需要其他指標(biāo)聯(lián)合診

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本

選取山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)病理學(xué)教研室2010—2015年尸體檢驗案例心肌標(biāo)本共30例，均于死后48～96h內(nèi)解剖，心肌標(biāo)本-80℃保存。實驗分為三組：顱腦損傷致死組10例，因交通事故致嚴(yán)重顱腦損傷而死亡，無冠狀動脈及其他心源性疾病，排除過敏性疾??；過敏性猝死組10例，經(jīng)尸體解剖、組織學(xué)觀察及實驗室檢驗嚴(yán)格排除中毒、暴力以及其他心源性疾病等，并結(jié)合過敏原接觸史、臨床表現(xiàn)、肥大細(xì)胞類胰蛋白酶測定等確診為過敏性猝死者；冠心病猝死組10例，經(jīng)尸體解剖及組織學(xué)觀察為冠狀動脈粥樣硬化，管腔狹窄程度≥Ⅲ級，但未發(fā)現(xiàn)明顯心肌梗死，嚴(yán)格排除過敏及其他心源性疾病，確診死因為冠心病猝死者。

1.1.2試劑和儀器

免疫熒光染色：小鼠抗人類胰蛋白酶抗體（AA1）、羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠IgG-TRITC（sc-3796）均購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司。

Western印跡法：兔抗人β-actin抗體（I102）購自美國Bioword Technology公司；小鼠抗人類胰蛋白酶抗體（ab2378）、兔抗人BNP抗體（ab92500）均購自美國Abcam公司，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（BA1050）、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（BA1054）均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1肥大細(xì)胞類胰蛋白酶的免疫熒光染色檢測

顱腦損傷致死組和過敏性猝死組選取左心室心肌組織，冠心病猝死組選取冠脈狹窄程度最重的相應(yīng)供血區(qū)心肌組織，甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋、4μm切片，脫蠟至水，微波法抗原修復(fù)，BSA封閉，實驗組由兔抗人肥大細(xì)胞類胰蛋白酶一抗（1∶400）、羅丹明標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶200）孵育，陰性對照組經(jīng)PBS以及羅丹明標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶200）孵育，空白對照組僅由PBS孵育；封片。BX61熒光顯微鏡（日本Olympus公司）進(jìn)行觀察，取熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的層面，每張切片200倍視野下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行拍照，應(yīng)用Image-pro plus 6.2軟件計數(shù)陽性顆粒數(shù)。

1.2.2肥大細(xì)胞類胰蛋白酶、BNP的Western印跡法檢測

顱腦損傷致死組和過敏性猝死組選取左心室心肌組織，冠心病猝死組選取冠脈狹窄程度最重的相應(yīng)供血區(qū)心肌組織各100mg，加入哺乳動物組織抽提試劑、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），液氮環(huán)境下充分研磨，4℃孵育3 h，4℃下以離心半徑10cm，12000r/min，離心10min。取上清液，BCA法蛋白定量；SDS-PAGE電泳，濕式轉(zhuǎn)印160mA、70 min轉(zhuǎn)印至PVDF膜；β-actin抗體（1∶5 000），類胰蛋白酶抗體（1∶1 000），BNP抗體（1∶4 000），4℃過夜；HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗（1∶2 000），HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶2000）室溫1h，ECL發(fā)光，Vision Works L S分析軟件（美國UVP公司）掃描Western印跡法結(jié)果，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示肥大細(xì)胞類胰蛋白酶、BNP的相對表達(dá)量。各組均以β-actin作為內(nèi)參照。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

實驗所得數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）t檢驗，數(shù)據(jù)用±s 表示。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1肥大細(xì)胞類胰蛋白酶的免疫熒光染色及檢測結(jié)果

在熒光的激發(fā)下，羅丹明產(chǎn)生643nm發(fā)射波長，肥大細(xì)胞類胰蛋白酶陽性染色為橙紅色，過敏性猝死組（圖1A）、冠心病猝死組（圖1B）心肌組織內(nèi)均出現(xiàn)較多肥大細(xì)胞類胰蛋白酶陽性染色；顱腦損傷致死組心肌偶見少量陽性染色（圖1C）；空白、陰性對照組心肌未見明顯陽性染色（圖1D）。心肌組織內(nèi)陽性肥大細(xì)胞類胰蛋白酶顆粒以心肌間質(zhì)中小血管周圍多見。三組間陽性顆粒兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2肥大細(xì)胞類胰蛋白酶的Western印跡法結(jié)果

各組類胰蛋白酶在心肌組織內(nèi)均有陽性表達(dá)，位于31000處。過敏性猝死組肥大細(xì)胞類胰蛋白酶表達(dá)最強(qiáng)，冠心病猝死組呈弱陽性表達(dá)，顱腦損傷致死組表達(dá)較弱（圖2）。三組肥大細(xì)胞類胰蛋白酶兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

2.3BNP的Western印跡法結(jié)果

各組BNP均有陽性表達(dá)，位于15000處。冠心病猝死組BNP表達(dá)最強(qiáng)，過敏性猝死組呈弱陽性表達(dá)，顱腦損傷致死組表達(dá)較弱（圖3）。冠心病猝死組BNP的表達(dá)量高于過敏性猝死組和顱腦損傷致死組（P＜ 0.05），過敏性猝死組與顱腦損傷致死組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表1　各組心肌組織內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶的表達(dá)?。╪=10，±s）

表1　各組心肌組織內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶的表達(dá)?。╪=10，±s）

注：1）與顱腦損傷致死組相比，P＜0.05；2）與過敏性猝死組相比，P＜0.05

組別　陽性顆粒數(shù)顱腦損傷致死　1.18±0.20過敏性猝死　32.24±0.951）冠心病猝死　20.86±0.601）2）

表2　各組心肌組織內(nèi)類胰蛋白酶和BNP與β-actin灰度值的比值?。╪=10，±s）

表2　各組心肌組織內(nèi)類胰蛋白酶和BNP與β-actin灰度值的比值?。╪=10，±s）

注：1）與顱腦損傷致死組相比，P＜0.05；2）與過敏性猝死組相比，P＜0.05

組別　類胰蛋白酶/β-actin　BNP/β-actin顱腦損傷致死　0.28±0.15　0.42±0.26過敏性猝死　0.88±0.121）　0.59±0.20冠心病猝死　0.53±0.071）2）　1.06±0.061）2）

3　討論

肥大細(xì)胞在心內(nèi)膜下、心外膜下、心肌細(xì)胞間及近血管周圍都有存在。肥大細(xì)胞類胰蛋白酶由肥大細(xì)胞表達(dá)，以活性形式儲存于肥大細(xì)胞顆粒中，當(dāng)肥大細(xì)胞活化后，胞質(zhì)內(nèi)的顆粒與胞膜融合，脫顆粒釋放類胰蛋白酶至組織間質(zhì)。研究［6-7］表明，過敏性休克患者體內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶的含量較正常人群高，并且在冷藏48h、冷凍7d的情況下，機(jī)體仍能維持其含量的穩(wěn)定。近期研究［8-11］發(fā)現(xiàn)，冠心病患者體內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶含量也升高，肥大細(xì)胞類胰蛋白酶通過分泌一系列蛋白酶、生長因子、細(xì)胞因子等促進(jìn)泡沫細(xì)胞生成、聚集，使局部膠原沉積，從而引起動脈粥樣硬化。本實驗中肥大細(xì)胞類胰蛋白酶的免疫熒光染色結(jié)果顯示，過敏性猝死組和冠心病猝死組心肌組織中均出現(xiàn)陽性顆粒。Western印跡法檢測結(jié)果顯示，顱腦損傷致死組、冠心病猝死組、過敏性猝死組心肌組織中肥大細(xì)胞類胰蛋白酶表達(dá)量依次遞增，且組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步證明了肥大細(xì)胞類胰蛋白酶表達(dá)量的增加并不一定意味著過敏反應(yīng)，過敏和冠心病猝死都會引起其增加，只是過敏性猝死后肥大細(xì)胞的激活程度更加顯著，而冠心病猝死后的激活程度是有限的。說明肥大細(xì)胞類胰蛋白酶可以為鑒別過敏性猝死和冠心病猝死提供一定的依據(jù)，但任何一個指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用都是有局限的，所以鑒別兩者尚需聯(lián)合其他指標(biāo)。

BNP是反映心源性猝死風(fēng)險大小的獨(dú)立指標(biāo)［12］。Hama等［13］發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死后，大鼠的左心室梗死區(qū)存活細(xì)胞、左心室非梗死區(qū)心肌細(xì)胞、右心室正常心肌細(xì)胞以及血漿的BNP表達(dá)量都會增加，且梗死區(qū)與非梗死區(qū)BNP的高表達(dá)程度基本一致。說明BNP是心肌負(fù)荷增大時的產(chǎn)物，在心肌梗死發(fā)生后，梗死區(qū)心肌變薄，使得不同區(qū)域間的張力增加，進(jìn)一步刺激了周圍的心肌細(xì)胞釋放BNP。另外，他還發(fā)現(xiàn)血漿BNP升高并不是由壞死心肌通透性增加引起的，而是與再合成有關(guān)。這說明心肌梗死后，BNP主要是由完整的心室肌細(xì)胞合成釋放的，所以BNP要比其他壞死心肌細(xì)胞的標(biāo)志物釋放早，對心肌缺血也更敏感。本實驗中冠心病猝死組心肌組織內(nèi)BNP的表達(dá)量明顯高于過敏性猝死組和顱腦損傷致死組，說明BNP可以作為診斷冠心病猝死的輔助指標(biāo)。此外，有報道［14］認(rèn)為過敏反應(yīng)也可導(dǎo)致心肌缺血、冠狀動脈痙攣等心臟事件的發(fā)生，但目前并不清楚究竟過敏反應(yīng)對心肌組織內(nèi)的BNP有無影響。本實驗中過敏性猝死組與顱腦損傷致死組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明過敏反應(yīng)對心肌組織內(nèi)的BNP影響不大。

本實驗結(jié)果表明，過敏性猝死后肥大細(xì)胞類胰蛋白酶明顯增加，而冠心病猝死后增加不明顯；過敏性猝死后BNP增加不明顯，而冠心病猝死后明顯增加。提示BNP能夠彌補(bǔ)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶的不足，其檢測結(jié)果升高可以反映出是否存在冠心病猝死。當(dāng)可疑過敏與冠心病并存時，經(jīng)系統(tǒng)的尸體解剖及病理觀察后，若檢測到肥大細(xì)胞類胰蛋白酶表達(dá)量增加，而BNP無明顯變化則死因傾向于過敏性猝死；若檢測到肥大細(xì)胞類胰蛋白酶表達(dá)量無明顯變化，而BNP明顯增加則死因傾向于冠心病猝死。因此，當(dāng)懷疑為過敏性猝死又難以排除冠心病猝死時，聯(lián)合檢測死后心肌組織內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和BNP，有望為鑒別診斷過敏性猝死與冠心病猝死提供一個新的思路。

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（本文編輯：黃平）

中圖分類號：DF795.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.001

文章編號：1004-5619（2016）03-0161-04

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上資助項目（81172905）；山西省科技攻關(guān)資助項目（20140313015-7）

作者簡介：史潔茹（1989─），女，碩士研究生，主要從事猝死病理學(xué)研究；E-mail：15535375426@163.com

通信作者：高彩榮，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事猝死病理學(xué)教學(xué)、研究和檢案；E-mail：gaocairong5175@163.com斷。研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）的表達(dá)量與心肌梗死面積、冠狀動脈病變的嚴(yán)重程度正相關(guān)，可以反映死前的心功能狀態(tài)。因此，本實驗應(yīng)用免疫熒光染色和Western印跡技術(shù)分析心肌組織內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和BNP的表達(dá)情況，旨在探討兩者在過敏性猝死和冠心病猝死鑒別診斷中的應(yīng)用價值。

收稿日期：（2014-03-09）

Expressions of Mast Cell Tryptase and Brain Natriuretic Peptide in Myocardium of Sudden Death due to Hypersensitivity and Coronary Atherosclerotic Heart Disease

SHI Jie-ru1，TIAN Cheng-jun2，ZENG Qiang1，GUO Xiang-jie1，LU Jian1，GAO Cai-rong1
（1.Department of Forensic Pathology，School of Forensic Medicine，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.Public Security Bureau of Yu Country，Yangquan 045100，China）

Abstract：Objective To explore the value of mast cell tryptase and brain natriuretic peptide（BNP）in the differential diagnostic of sudden death due to hypersensitivity and coronary atherosclerotic heart disease.Methods Totally 30 myocardial samples were collected from the autopsy cases in the Department of Forensic Pathology，Shanxi Medical University during 2010—2015.All samples were divided into three groups：death of craniocerebral injury group，sudden death of hypersensitivity group and sudden death of coronary atherosclerotic heart disease group，10 cases in each group.Mast cell tryptase and BNP in myocardium were detected by immunofluorescence staining and Western Blotting.Results Immunofluorescence staining showed that the positive staining mast cell tryptase appeared in myocardium of sudden death of hypersensitivity group and coronary atherosclerotic heart disease group.Among the three groups，the expression of mast cell tryptase showed significantly differences through pairwise comparison（P＜0.05）；The expression level of BNP in sudden death of coronary atherosclerotic heart disease group were significantly higher than the sudden death of hypersensitivity group and death of craniocerebral injury group（P＜0.05）. The difference of the expression level of BNP between the sudden death of hypersensitivity group and the death of craniocerebral injury group had no statistical significance（P＞0.05）.Conclusion The combined detection of the mast cell tryptase and BNP in myocardium is expected to provide help for the forensic differential diagnosis of sudden death due to hypersensitivity and coronary atherosclerotic heart disease.

Key words：forensic pathology；death，sudden；anaphylaxis；coronary arteriosclerosis；mast cells；tryptases；natriuretic peptide，brain