朱培，李崎，朱林江，賀鵬宇，李永仙*

1(江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無錫，214122)　2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

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大麥β-淀粉酶基因在大腸桿菌中的異源表達

朱培1，李崎2，朱林江3，賀鵬宇4，李永仙1*

1(江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

摘要大麥來源的β-淀粉酶具有穩(wěn)定性高和工業(yè)應(yīng)用效果好的優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品、釀造以及糧食加工，但是其制備成本高，價格較昂貴。該研究使用大腸桿菌異源表達大麥來源的β-淀粉酶。首先通過基因合成技術(shù)獲得密碼子優(yōu)化的大麥來源的β-淀粉酶基因，將該基因通過質(zhì)粒pET28a(+)在大腸桿菌BL21(DE3)中過量表達獲得重組β-淀粉酶。其次，對重組表達的β-淀粉酶和大麥中直接提取的β-淀粉酶進行酶學(xué)性質(zhì)比較分析。結(jié)果表明，重組表達的β-淀粉酶其分子質(zhì)量大小與大麥中β-淀粉酶一致，即59 kDa，重組的β-淀粉酶比酶活由大麥來源的588 U/mg降為285.5 U/mg，最適作用溫度降低了10 ℃，最適pH保持一致。所以，大麥β-淀粉酶能夠在細菌中高效表達，但是其酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生較大改變。

關(guān)鍵詞大麥；β-淀粉酶；異源表達；大腸桿菌

淀粉酶是水解淀粉和糖原的一類酶的總稱，主要存在于動物、植物以及微生物中[1]，一般作用于可溶性淀粉、糖原、α-1,4-葡聚糖等，水解其中的α-1,4-糖苷鍵。根據(jù)氨基酸序列的同源性，分屬糖苷水解酶類的14族[2]。根據(jù)淀粉酶對淀粉的不同催化水解方式，可將其分為4種淀粉酶，即α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和脫支酶。其中β-淀粉酶，又稱α-1,4-葡聚糖麥芽糖水解酶(EC3.2.1.2)，是一種外切型淀粉酶。它從淀粉的非還原性末端開始，依次切開間隔的α-1,4糖苷鍵，生成麥芽糖和β-極限糊精[3]，其在啤酒釀造、糖漿制造、紡織與醫(yī)療中具有重要應(yīng)用[4-5]。

現(xiàn)有β-淀粉酶酶制劑主要來源于植物提取和微生物發(fā)酵生產(chǎn)。其中植物來源β-淀粉酶酶制主要提取于大麥、甘薯、大豆等糧食作物中[6]，而微生物生產(chǎn)β-淀粉酶酶制主要是通過枯草芽孢桿菌等表達生產(chǎn)。相比于微生物來源的β-淀粉酶，植物來源的β-淀粉酶具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、pH作用范圍廣等特點[7]，所以受工業(yè)應(yīng)用的偏愛，其中應(yīng)用最廣泛的是大麥來源的β-淀粉酶酶制劑。但是，大麥β-淀粉酶經(jīng)過提取獲得，不但消耗大量的大麥[8]，而且制備成本偏高，其價格高居不下。雖然微生物產(chǎn)β-淀粉酶可實現(xiàn)高酶活發(fā)酵，而且誘變后可提高其酶活力和熱穩(wěn)定性[9]，但是根據(jù)工廠應(yīng)用經(jīng)驗，比如在制糖過程中，微生物產(chǎn)β-淀粉酶仍難以達到大麥來源酶制劑的使用效果。因此本論文將大麥β-淀粉酶基因?qū)氪竽c桿菌中進行異源表達[8,10]，研究大腸桿菌重組的β-淀粉酶的性質(zhì)，同時將其與大麥來源的β-淀粉酶進行比較。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1β-淀粉酶基因來源

通過NCBI查得大麥來源β-淀粉酶基因序列(GenBank：D21349.1)，交付蘇州金唯智生物科技有限公司合成，獲得完整的密碼子優(yōu)化的大麥β-淀粉酶基因序列，預(yù)設(shè)計酶切位點為XhoI與NdeI。

1.1.2質(zhì)粒以及其他試劑

質(zhì)粒pMD19T-simple購自TaKaRa生物工程有限公司，表達載體pET28a(+)質(zhì)粒，大腸桿菌JM109與BL21(DE3)均由本研究室保藏。TaqDNA polymerase、克隆載體pMD19T-simple、Mini BEST基因組提取試劑盒、感受態(tài)細胞制作試劑盒、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XhoI和NdeI購自TaKaRa生物工程有限公司；San prep柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1重組表達載體的構(gòu)建

大麥β-淀粉酶基因amyB首先插入到pMD19T-simple載體進行亞克隆以方便基因后續(xù)插入到pET28a(+)中，將重組質(zhì)粒交由上海生工公司測序。雙酶切獲得目的基因，將目的基因與雙酶切后的pET28a(+)質(zhì)粒連接后，涂布與含硫酸卡那霉素的LB平板于37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選陽性pET28a(+)-amyB重組表達質(zhì)粒單菌落于50 mL LB培養(yǎng)基后，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證。所有限制性酶切反應(yīng)體系均參照試劑盒說明書配制。

1.2.2大腸桿菌的誘導(dǎo)表達

挑取含pET28a(+)-amyB重組表達質(zhì)粒單菌落于含有硫酸卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)；以4%的接種量轉(zhuǎn)接到含硫酸卡納霉素的50 mL的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至OD600≈1.0時加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.06 mmol/L；轉(zhuǎn)移至24 ℃ 150 r/min培養(yǎng)6 h后于4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，收集菌體及上清液；上清液經(jīng)透析后使用蛋白超濾管濃縮，于4 ℃保存，同時培養(yǎng)含有空pET28a(+)質(zhì)粒的宿主菌，誘導(dǎo)培養(yǎng)作為陰性對照。

1.2.3重組蛋白的收集與純化鑒定[11-12]

菌液離心去其上清液，加入磷酸緩沖液懸浮后在冰浴條件下利用超聲細胞破碎儀破碎細胞，使超聲時間累積15 min(工作時間:4 s；間隙時間:6 s；工作次數(shù):90)后4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，收集上清液，作為粗蛋白樣品。用pH 7.0磷酸鹽緩沖液稀釋10倍后，采用鎳柱純化和AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行分離，其中AKTA蛋白純化選擇陰離子交換色譜Mono Q。純化結(jié)束后收集吸收峰，進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.4大麥來源β-淀粉酶的純化

用pH 6.0磷酸緩沖液稀釋大麥來源的β-淀粉酶酶制劑，采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行分離，選擇凝膠柱Superdex G75。過柱完成后收集吸收峰，經(jīng)過SDS-PAGE電泳進行檢測。

1.2.5β-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)分析[13-14]

使用Megazyme公司的Beta-Amylase Assay Procedure試劑盒分別測定β-淀粉酶的最適溫度(溫度范圍40～70 ℃)、50 ℃溫度穩(wěn)定性、最適pH(pH范圍4.0～8.0)與pH 6.0時的穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1pET28a(+)-amyB表達載體的構(gòu)建與在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達

pET28a(+)-amyB的XhoI與NdeI雙酶切結(jié)果如圖1A所示，圖中大小在1 600 bp左右為目的基因，測序結(jié)果證實重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將其重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE 3)中進行誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)表達后，收集破碎細菌液上清后經(jīng)SDS-PAGE分析，由圖1B可見，與誘導(dǎo)表達空pET28a(+)質(zhì)粒的宿主菌相比較，重組載體誘導(dǎo)表達后在60 kDa左右處有明顯的特異條帶，說明新載體在誘導(dǎo)表達后有新蛋白產(chǎn)生，而大麥來源的β-淀粉酶的蛋白分子質(zhì)量在59 kDa左右。此外，對該蛋白條帶進行回收純化，用于質(zhì)譜鑒定，其肽段匹配結(jié)果與蛋白NCBI ID為gi|113786相似度最大，分子質(zhì)量為59 609，為大麥β-淀粉酶來源。

(A)重組質(zhì)粒pET28a(+)-amyB的XhoI與NdeI雙酶切核酸電泳圖M-DNAMarker；1-XhoI和NdeI雙酶切)(B)重組質(zhì)粒pET28a(+)-amyB大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達β-淀粉酶電泳圖M-蛋白質(zhì)標準分子量；1-誘導(dǎo)含空質(zhì)粒pET28a(+)的大腸桿菌胞內(nèi)蛋白；2-誘導(dǎo)含質(zhì)粒pET28a(+)-amyB的胞內(nèi)蛋白圖1　重組質(zhì)粒pET28a(+)-amyB的雙酶切驗證與重組β-淀粉酶的誘導(dǎo)表達電泳圖Fig.1　Digestion of recombinant plasmid and induced expression of recombinant β-amylase

2.2重組β-淀粉酶的純化[15]

由于重組β-淀粉酶含有組氨酸標記，因此首選鎳柱純化粗酶液。多次重復(fù)試驗表明目的蛋白與雜蛋白同時被洗脫，重組β-淀粉酶無法與鎳柱結(jié)合。如圖2A所示，目的蛋白隨著雜蛋白在50 mmol/L咪唑濃度下一起被洗脫下來(箭頭所示為目的蛋白)。因此改用AKTA蛋白純化系統(tǒng)來純化重組表達的β-淀粉酶。收集的上清液經(jīng)過透析，超濾濃縮后，選擇陰離子交換色譜柱Mono Q進一步純化β-淀粉酶，通過預(yù)實驗，采用含有0.15 mol/L NaCl pH 7.4的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫峰經(jīng)過SDS-PAGE鑒定其中峰A6是BL21(DE3)異源表達的大麥β-淀粉酶，如圖2C所示，純化的最終結(jié)果得到1條單一的蛋白條帶，大小在59 kDa左右。

(A)粗酶液的鎳柱洗脫結(jié)果的SDS-PAGE電泳比較M-蛋白質(zhì)標準分子量；1～6-洗脫液咪唑濃度分別為:20、50、100、150、200、250 mmol/L(B)粗酶液的MonoQ純化峰圖(C)重組β-淀粉酶的誘導(dǎo)表達電泳圖M-蛋白質(zhì)標準分子量；1-純化前的重組蛋白；2-純化后的重組蛋白圖2　重組菌誘導(dǎo)表達β組淀粉酶的純化Fig.2　Purification of expressed β-amylase

2.3大麥來源的β-淀粉酶的純化

為了比較分析大腸桿菌中異源表達的β-淀粉酶性質(zhì)，對同一大麥品種來源的β-淀粉酶制劑進行了純化。使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化大麥來源β-淀粉酶酶制劑，選擇凝膠色譜柱Superdex G75純化大麥β-淀粉酶，以pH 6.0的PBS洗脫。凝膠過濾色譜Superdex G75峰圖見圖3A，SDS-PAGE鑒定結(jié)果為峰B6為β-淀粉酶，純化結(jié)果如圖3B所示，SDS-PAGE得到單一清晰條帶，蛋白分子質(zhì)量在59 kDa附近。

(A)β-淀粉酶Superdex G-75純化峰圖(B)大麥來源β-淀粉酶的SDS-PAGE結(jié)果M-蛋白質(zhì)標準分子量；1-純化前的粗蛋白；2-純化后的β-淀粉酶圖3　大麥來源β-淀粉酶的純化Fig.3　Purification of β-amylase from Barley

2.4重組β-淀粉酶與大麥來源β-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)比較

取純化后的重組β-淀粉酶酶液(485.5 U/mL)與大麥來源純化的β-淀粉酶酶液(10 000 U/mL)，使用愛爾蘭Megazyme公司的Beta-Amylase Assay Procedure試劑盒專一性測定β-淀粉酶的酶活，從而比較比酶活、最適溫度、溫度穩(wěn)定性、最適pH與pH穩(wěn)定性，結(jié)果如表1所示。

表1　不同來源β-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)的比較

如圖4A所示，大麥來源的β-淀粉酶的最適溫度為55 ℃，大腸桿菌重組表達的β-淀粉酶的最適溫度變?yōu)?5 ℃，與大麥來源β-淀粉酶相比，重組酶的最適溫度下降了10 ℃。

分別在50 ℃條件下處理大麥來源、大腸桿菌表達的β-淀粉酶，測其酶活，結(jié)果如圖4B所示。在50 ℃時，重組蛋白的半衰期相比原始β-淀粉酶減少了40 min，發(fā)現(xiàn)β-淀粉酶在大腸桿菌中重組表達后熱穩(wěn)定性顯著下降。

使用不同pH的磷酸緩沖液比較β-淀粉酶酶活，在40 ℃條件下測其酶活，如圖4C所示，兩種β-淀粉酶的最適pH均為6.0。

在pH 6.0的磷酸緩沖液中，在40 ℃條件下測兩種β-淀粉酶的pH穩(wěn)定性，如圖4D所示。兩種β-淀粉酶的半衰期大概都在6 h左右，下降趨勢差別不大，經(jīng)過大腸桿菌的重組表達后，β-淀粉酶的pH穩(wěn)定性與原大麥β-淀粉酶的pH穩(wěn)定性相比基本保持不變。

(A)最適溫度的比較；(B)50 ℃時的熱穩(wěn)定性的比較；(C)最適作用pH的比較；(D)pH 6.0時的穩(wěn)定性的比較圖4　重組β-淀粉酶與直接來源大麥的β-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)比較分析Fig.4　Comparative analysis of enzymatic properties between recombinant β-amylase and purified barley β-amylase

3討論

論文針對大麥來源的β-淀粉酶在大腸桿菌中異源表達進行了研究，結(jié)果表明經(jīng)過密碼子優(yōu)化的大麥β-淀粉酶能夠在大腸桿菌中高效表達，通過SDS-PAGE分析能夠清晰判斷，高于之前的研究報道[16]。但是，經(jīng)過凝膠色譜柱和離子交換柱純化后的重組β-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)與大麥中直接提取的β-淀粉酶具有一定差異。重組β-淀粉酶的熱穩(wěn)定性下降了10 ℃，比酶活由大麥來源的588 U/mg降為285.5 U/mg；而重組表達對酶的最適作用pH和pH穩(wěn)定性影響不大。重組的β-淀粉酶的熱穩(wěn)定性和比酶活下降，這一研究結(jié)果與之前的報道不一致，可能是由于不同的β-淀粉酶基因、不同的E.coli菌株、不同的酶純化方法造成的。而本次研究重組β-淀粉酶的熱穩(wěn)定性和比酶活均低于原大麥中純化的酶，這可能是由于真核來源的蛋白質(zhì)在原核生物宿主中表達時，其三級結(jié)構(gòu)的折疊以及蛋白的修飾不同造成的。大麥β-淀粉酶是來源于真核生物，通過糖基化修飾后可使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[17]，而大腸桿菌的表達系統(tǒng)并無糖基化修飾系統(tǒng)，糖基化或許是重組蛋白最適溫度與溫度穩(wěn)定性下降的原因。

此外，對純β-淀粉酶的研究過程中發(fā)現(xiàn)，不管是重組表達的β-淀粉酶，還是直接從大麥中純化的β-淀粉酶，都是一種極不穩(wěn)定的酶，容易失活。然而在自然狀態(tài)下，大麥提取的β-淀粉酶酶制劑可以較穩(wěn)定的保持活性。因此，通過本次純的β-淀粉酶的比較研究，推測在大麥提取液中存在某些物質(zhì)，能夠保護β-淀粉酶，提高其酶活半衰期，這也可能是植物來源的β-淀粉酶酶制劑具有更好地工業(yè)應(yīng)用效果的原因之一。

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Heterologous expression of β-amylase gene from barley inE.coli

ZHU Pei1,LI Qi2,ZHU Lin-jiang3,HE Peng-yu4,LI Yong-xian1*

1(Lab of Brewing Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTBarley β-amylase is widely applied in food and brewing industries due to its high activities, good stability and performance. However, the low production rate and high price of barley β-amylase limit its application. In this study, the barley β-amylase was heterologously expressed in Escherich coli. The β-amylase gene was codon-optimized, inserted into plasmid pET28a (+) and over-expressed in E.coli BL21 (DE3) cells. After comparing the recombinant β-amylase with the native one from barley, the results showed that the molecular weight of the recombinant β-amylase was similar with that of the native barley β-amylase, which was about 59 kDa. Its specific activity was decreased to 285.5U/mg, which was lower than that of the enzyme from barley (588 U/mg). Furthermore, its optimum temperature was declined 10 ℃, while its optimum pH kept consistent. Therefore, barley β-amylase gene could be effectively over-expressed in bacterial cells, while its enzymatic properties altered greatly.

Key wordsbarley; β-amylase; heterologous expression; Escherichia coli

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606006

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費資金和江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目

收稿日期：2015-12-09，改回日期：2016-01-20

第一作者：碩士研究生(李永仙為通訊作者,E-mail：yxli@jiangnan.edu.cn)。