李銳，劉芳，李蕓香，賈坤，張秀梅，徐偉，蘇國(guó)龍，黃維維，羅靜雯

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039) 2(四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都，610041)

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微生物轉(zhuǎn)化法制備雙脫甲氧基姜黃素糖苷化產(chǎn)物及其對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞的抑制作用

李銳1*，劉芳1，李蕓香1，賈坤1，張秀梅1，徐偉1，蘇國(guó)龍1，黃維維1，羅靜雯2

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039) 2(四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都，610041)

摘要雙脫甲氧基姜黃素是一種具有極強(qiáng)抗氧化活性和抗腫瘤活性的天然酚類成分，但是極差的水溶性和穩(wěn)定性制約了其在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。通過微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，引入親水性的葡萄糖苷鍵基團(tuán)是有效解決其水溶性的手段。該研究利用不同微生物體系對(duì)雙脫甲氧基姜黃素進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)華根霉Rhizopus chinensis IFFI 3043能夠?qū)㈦p脫甲氧基姜黃素(Bisdemethoxycurcumin，BDMC)轉(zhuǎn)化為雙脫甲氧基姜黃素-O-葡萄糖苷(BDMC-O-glucoside)，且轉(zhuǎn)化效率達(dá)到63%。研究利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合(high performance liquid chromatography-mass spectormeter,HPLC-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等檢測(cè)手段，確認(rèn)了BDMC-O-glucoside轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，完成了其轉(zhuǎn)化過程的動(dòng)態(tài)曲線分析，并通過MTT細(xì)胞毒活性法發(fā)現(xiàn)BDMC-O-glucoside對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞的抑制作用顯著強(qiáng)于BDMC。

關(guān)鍵詞雙脫甲氧基姜黃素；華根霉；生物轉(zhuǎn)化；糖苷化；抗腫瘤

姜黃為姜科姜黃屬植物姜黃(CurcumalongaL.)的干燥根莖，主產(chǎn)于中國(guó)、印度、日本等國(guó)家，其提取物主要用于食品添加劑及天然色素生產(chǎn)[1-2]。姜黃素(curcumin)、脫甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、雙脫甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin, BDMC)為代表的姜黃素類化合物是姜黃的主要活性成分[3-4]。有研究報(bào)道表明，姜黃素類化合物具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥作用以及抗阿爾茨默癥等生理活性[5-8]，雙脫甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin, BDMC)在化學(xué)結(jié)構(gòu)上缺少2個(gè)甲氧基基團(tuán)(結(jié)構(gòu)式見圖1)，使其在抗氧化和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面的活性甚至優(yōu)于其他兩種姜黃素[9-11]，且該類化合物無毒副作用，是一種在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域極具開發(fā)潛力的天然酚類活性成分。

由于雙脫甲氧基姜黃素水溶性差、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，使其在食品和醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用受到極大的限制。其在酸性和中性pH環(huán)境中幾乎不溶，只溶于丙酮、甲醇等少數(shù)有機(jī)溶劑，且久置或光照容易分解。因此，保持雙脫甲氧基姜黃素原有生物活性的基礎(chǔ)上，獲得該類成份新的衍生物與類似物，改變其物理、化學(xué)性質(zhì)成為近期研究的熱點(diǎn)。其中，天然產(chǎn)物的糖苷化，是一種改變其水溶性的有效手段[12]。但是尚未有通過化學(xué)合成將葡萄糖苷鍵與其結(jié)合的報(bào)道，因?yàn)榻S素類化合物的結(jié)構(gòu)特殊，其獨(dú)特的1,7-二芳基庚酸骨架存在烯醇互變體，在化學(xué)合成反應(yīng)中極不穩(wěn)定，容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。

圖1　雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structure of bisdemethoxycurcumin (BDMC)

本文利用不同微生物體系對(duì)雙脫甲氧基姜黃素進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化研究，發(fā)現(xiàn)華根霉(Rhizopuschinensis) IFFI 3043能夠有效地將葡萄糖苷鍵鏈接在雙脫甲氧基姜黃素的羥基基團(tuán)(-OH)上，形成糖苷化產(chǎn)物，且轉(zhuǎn)化效率達(dá)到63%。我們利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合(high performance liquid chromatograpty-mass spectormeter,HPLC-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等檢測(cè)手段，確認(rèn)了糖苷化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，完成了轉(zhuǎn)化過程動(dòng)態(tài)曲線分析，并通過MTT細(xì)胞毒活性法研究了其對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞的抑制作用。

1材料與方法

1.1試劑與材料

硅膠G (柱色譜用200～300目)為青島海洋化工廠產(chǎn)品。所用試劑乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、甲醇等均為成都科龍?jiān)噭┊a(chǎn)品，分析純。雙脫姜黃素(BDMC)由實(shí)驗(yàn)室分離獲得，純度經(jīng)HPLC檢測(cè)達(dá)到95%以上。

1.2微生物培養(yǎng)及生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

微生物培養(yǎng)：所有菌株購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，4 ℃下保存于固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基的配制：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，置燒杯中加水1.0 L煮沸30 min，濾除馬鈴薯塊，將葡萄糖20 g加入濾液中，攪拌至完全溶解，再補(bǔ)足濾液至1 L。固體斜面培養(yǎng)基另加2.5%瓊脂。以上培養(yǎng)基分裝后封口，于121 ℃, 1.06 kg/cm2條件下濕熱滅菌30 min。

生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：將菌株接種于300 mL三角瓶中，每瓶盛100 mL液體培養(yǎng)基，25 ℃下于180 r/min搖床上避光培養(yǎng)24 h。吸取其中7 mL菌液置于1 000 mL三角瓶中，每瓶盛400 mL液體培養(yǎng)基，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)菌絲生長(zhǎng)旺盛時(shí)，按照每瓶12 mg劑量，加入BDMC底物。對(duì)照組：在實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)立菌液空白對(duì)照組，對(duì)照組不加入DMC底物，于180 r/min搖床上25 ℃避光條件下，按照實(shí)驗(yàn)組相同方法進(jìn)行平行培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)立底物對(duì)照組，即未接種微生物的空白培養(yǎng)基中加入相同量的BDMC底物，平行操作后進(jìn)行分析。

1.3菌種篩選

本實(shí)驗(yàn)對(duì)5株真菌(見表1)進(jìn)行BDMC的生物轉(zhuǎn)化預(yù)試，經(jīng)HPLC分析，若檢測(cè)到BDMC經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后被大量消耗，則證明該真菌對(duì)BDMC的生物轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)，以此篩選轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)的菌株。

表1　五種不同微生物菌株對(duì)BDMC的生物轉(zhuǎn)化預(yù)實(shí)驗(yàn)

Note: +++,BDMC大量被轉(zhuǎn)化; +, BDMC少量被轉(zhuǎn)化; -, BDMC無法被轉(zhuǎn)化。

1.4HPLC分析及LC/MS分析

HPLC分析方法：使用Agilent系列1200高效液相色譜儀，配有DAD檢測(cè)器。色譜柱：YMC-Pack-ODS-A C18reversed column (250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm) 及Agilent Zorbax SB-C18保護(hù)柱 (12.5 mm×4.6 mm i.d., 5 μm)。流動(dòng)相：乙腈(A)-水溶液(B)，洗脫程序：0～15 min：20%～40% A；8～10 min：40%～54% A；10～24 min：54% A； 24～37 min：54%～95% A。柱溫：30 ℃ ；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為425 nm。

LC/MS分析方法：LCQ Advantage型離子阱質(zhì)譜儀(Thermo, USA)通過電噴霧離子源(ESI)與Aglient 1200液相色譜儀相連。HPLC流出液經(jīng)分流后進(jìn)入離子源進(jìn)行分析。霧化氣為高純氮?dú)?N2)，碰撞氣為超高純氦氣(He)。質(zhì)譜條件為：鞘氣，45 u；助氣，10 u；進(jìn)樣毛細(xì)管溫度，325 ℃；毛細(xì)管電壓，-4 V；透鏡電壓，-45 V。負(fù)離子模式檢測(cè)，質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～1 000。

1.5NMR結(jié)構(gòu)鑒定

1H NMR、13C NMR及2D-NMR采用Bruker Avance III (1H: 400 MHz;13C: 100 MHz)型核磁共振儀測(cè)定。

1.6MTT細(xì)胞毒活性法

采用MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。在DEME低糖培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按5×104/mL接種于96孔板。將不同濃度的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物溶液(0.5% DMSO為溶媒)準(zhǔn)確加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃,5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。于每孔加入20 μL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再想每孔中加入150 μL DMSO溶解結(jié)晶物，搖床振蕩10 min后于全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)的OD值。按公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率：

(1)

分別設(shè)計(jì)對(duì)照組(0.5% DMSO溶劑)和空白組，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均測(cè)量3次取平均值。

2結(jié)果與分析

2.1菌株選擇

由表1可知，華根霉RhizopuschinensisIFFI 3043對(duì)BDMC的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，通過HPLC檢測(cè)到大量BDMC底物被消耗；而釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeACCC 2168對(duì)BDMC少量轉(zhuǎn)化；另外3種菌株：鏈格孢AlternariaalternateAS 3.4578、總狀共頭霉SyncephalastrumracemosumAS 3.264、藍(lán)色梨頭霉AbsidiacoeruleaBainier AS 3.3389對(duì)BDMC不產(chǎn)生轉(zhuǎn)化作用。綜合考慮轉(zhuǎn)化率與提取率等因素，選擇華根霉RhizopuschinensisIFFI 3043對(duì)BDMC進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

2.2華根霉素RhizopuschinensisIFFI 3043對(duì)BDMC的放大生物轉(zhuǎn)化

按照1.2小節(jié)方法進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，向培養(yǎng)的R.chinensis菌液中，每瓶中加入12 mg BDMC的丙酮溶液，共計(jì)加入1200 mg底物。繼續(xù)共培養(yǎng)3 d，濾除菌絲，濾液以乙酸乙酯萃取5次，有機(jī)相合并濃縮，蒸干獲得5.5 g浸膏備用。

2.3轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC-MS定性分析

將加入BDMC底物轉(zhuǎn)化前的菌液和轉(zhuǎn)化48 h后菌液以乙酸乙酯萃取后，制備檢測(cè)樣品，采用HPLC-MS分析獲得BDMC轉(zhuǎn)化前后的HPLC圖譜(如圖2所示)。BDMC經(jīng)轉(zhuǎn)化48 h后基本被完全消耗，425 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下在18 min左右檢測(cè)到產(chǎn)物1的峰信號(hào)，為極性比BDMC更大的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

通過對(duì)產(chǎn)物1進(jìn)行ESIMS分析可知，其MS1出現(xiàn)m/z469的[M-H]-分子離子峰，其MS2出現(xiàn)m/z307的雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)的特征離子峰[8]，推測(cè)其為丟失162 Da (六碳糖)中性離子產(chǎn)生，而MS2出現(xiàn)的碎片離子m/z187和m/z119均為BDMC

的特征離子峰，此外，UV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物1的最大紫外吸收波長(zhǎng)為414 nm，為姜黃素類化合物的特征吸收范圍。綜合以上檢測(cè)結(jié)果推導(dǎo)，初步確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物產(chǎn)物1為雙脫甲氧基姜黃素-O-葡萄糖苷，即BDMC-O-glucoside。

圖2　(A) 轉(zhuǎn)化前BDMC的HPLC圖譜；(B) 轉(zhuǎn)化48 h后剩余BDMC和產(chǎn)物1的HPLC圖譜Fig.2　(A) The HPLC chromatograms of BDMC before biotransformation; (B) The HPLC chromatograms of biotransformed product 1 and remnant BDMC after 48 h biotransformation

(A) BDMC-O-glucoside的化學(xué)結(jié)構(gòu)及LC/MS裂解途徑; (B) BDMC-O-glucoside的[M-H]- 離子峰及MS2 裂解圖譜; (C) BDMC-O-glucoside的UVmax圖譜圖3　HPLC-DAD-ESI/MS法鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1(BDMC-O-glucoside)的結(jié)構(gòu)Fig.3　Identification of the biotransformed product 1 (BDMC-O-glucoside) by HPLC/DAD/ESI-MS

2.4轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離與NMR結(jié)構(gòu)鑒定

2.2項(xiàng)下浸膏(5.5 g)經(jīng)硅膠柱G色譜分離，以三氯甲烷-(甲醇)(100∶1, 50∶1 和10∶1,v/v)分別進(jìn)行梯度洗脫。洗脫的餾分經(jīng)薄層色譜檢查，成分相似的餾分合并得到10個(gè)部分。餾分8經(jīng)制備液相色譜進(jìn)一步純化，以甲醇-水(50∶50,v/v)等度洗脫，分離得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物共計(jì)626 mg。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物產(chǎn)物1為黃色粉末，EIMS在m/z469.2處顯示[M]+峰，提示其分子量為469。其分子量比雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)大162 Da，推測(cè)分子中有六碳糖取代。經(jīng)1H NMR、13C NMR及2D-NMR數(shù)據(jù)分析，碳譜中顯示出糖的共振峰，其中ε101.1為端基碳信號(hào)(glc-1′)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1的C-4′較雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)的C-4′向低場(chǎng)位移至ε150.2 (△ε+0.7)，提示有基團(tuán)在此處取代；此外，2D-NMR分析中顯示出H (glc-1′)與C-4′較強(qiáng)的HBMC遠(yuǎn)程相關(guān)，提示糖基取代在BDMC結(jié)構(gòu)的4′-位。參考已發(fā)表文獻(xiàn)[4]，將糖基的碳、氫信號(hào)與已知化合物結(jié)構(gòu)對(duì)比，確定該糖基為葡萄糖，糖苷鍵為β-構(gòu)型。經(jīng)過鑒定確認(rèn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1結(jié)構(gòu)與LC/MS推測(cè)結(jié)果完全一致，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為雙脫甲氧基姜黃素 4′-O-β-D-葡萄糖苷 (BDMC-O-glucoside); 外觀形狀及1H、13C數(shù)據(jù)如下所示：黃色粉末。UV (MeOH)λmax: 414 nm;1H NMR (acetone-d6, 400 MHz): ε(ppm) 7.62 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-1), 7.61 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 6.9-7.41 (8H, m, H-Ar), 6.78 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-2), 6.74 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-6), 6.01 (1H, s, H-4), 5.05 (1H, d, J = 7.2 Hz, Glc-H-1), 3.40-4.30 (6H, m, Glc-H);13C NMR (acetone-d6, 100 MHz): ε(ppm) 184.3 (C-3), 183.4 (C-5), 150.2 (C-4′), 149.5 (C-4″), 149.5 (C-3′), 148.4 (C-3″), 141.4 (C-1), 139.8 (C-7), 129.6 (C-1′), 127.1 (C-1″), 123.5 (C-2), 122.5 (C-6), 122.1 (C-6′), 121.2 (C-6″), 116.6 (C-5′), 115.7 (C-5″), 111.8 (C-2′), 110.3 (C-2″), 101.3 (C-4), 101.1 (glc-1′), 77.2 (glc-2′), 77.1 (glc-3′), 73.7 (glc-4′), 70.5 (glc-5′), 61.5 (glc-6′); ESIMS:m/z469.0 [M-H]-，以上數(shù)據(jù)和參照文獻(xiàn)中BDMC數(shù)據(jù)一致[4]。根據(jù)以上推導(dǎo)，確定轉(zhuǎn)化合物產(chǎn)物1的結(jié)構(gòu)為：雙脫甲氧基姜黃素4′-O-β-D-葡萄糖苷。

2.5轉(zhuǎn)化過程的動(dòng)態(tài)分析

由以上研究結(jié)果可得出BDMC經(jīng)華根霉RhizopuschinensisIFFI 3043轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)化路徑圖，如圖4所示。本研究進(jìn)一步考察了再48 h之內(nèi)，BDMC及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物BDMC-O-glucoside在培養(yǎng)液中濃度與培養(yǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化關(guān)系。在0、2、4、6、8、12、24、48 h不同時(shí)間點(diǎn)取樣，樣品經(jīng)萃取處理后進(jìn)HPLC在420 nm下檢測(cè)，在不同時(shí)間點(diǎn)以BDMC和BDMC-O-glucoside的峰面積計(jì)算得出動(dòng)態(tài)變化曲線。如圖5所示，在48 h內(nèi)BDMC被華根霉RhizopuschinensisIFFI 3043快速轉(zhuǎn)化，BDMC-O-glucoside的產(chǎn)率達(dá)到63%(以峰面積計(jì)算)，而在24 h和48 h檢測(cè)到BDMC-O-glucoside濃度比12 h略有下降，可能是由于轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的濃度增大，在培養(yǎng)液中由于溶解度不夠造成的不均勻分布導(dǎo)致。

圖4　雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)經(jīng)華根霉R. chinensis IFFI 3043生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Fig.4　Biotransformation of BDMC by R. chinensis IFFI 3043, and its product

圖5　BDMC轉(zhuǎn)化為BDMC-O-glucoside的轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)分析Fig.5　Biotransformation kinetics of BDMC to BDMC-O-glucoside

2.6BDMC-O-glucoside與BDMC的抗腫瘤活性比較

為研究BDMC-O-glucoside對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，實(shí)驗(yàn)設(shè)立BDMC組作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)方法同1.6。結(jié)果顯示在各個(gè)不同濃度的實(shí)驗(yàn)組別中，BDMC-O-glucoside比BDMC對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞都有更好的抑制作用(P<0.05)(見圖6)，當(dāng)BDMC-O-glucoside的濃度為40 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率僅為18.7%，而BDMC組的HepG2細(xì)胞存活率為37.8%。由于葡萄糖苷鍵的存在，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物BDMC-O-glucoside相比原型成分BDMC的極性和水溶性都得到了提高，通過生物轉(zhuǎn)化引入極性基團(tuán)-葡萄糖苷鍵可能是其抗腫瘤細(xì)胞活性增強(qiáng)的原因。

圖6　BDMC與BDMC-O-glucoside對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制作用比較研究Fig.6　The comparison of inhibitory effect to HepG2 cells between BDMC and BDMC-O-glucoside

3”結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)為目標(biāo)，通過對(duì)不同微生物菌株的篩選，確定了華根霉RhizopuschinensisIFFI 3043對(duì)BDMC有最強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力；以HPLC檢測(cè)建立了底物與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物之間轉(zhuǎn)化過程的動(dòng)態(tài)曲線分析；通過LC/MS方法推測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，并通過放大實(shí)驗(yàn)獲得大量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物純品進(jìn)行NMR測(cè)試，最終確認(rèn)其結(jié)構(gòu)為雙脫甲氧基姜黃素 4′-O-β-D-葡萄糖苷 (BDMC-O-glucoside)；此外，通過MTT法初步證明了BDMC-O-glucoside對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞的抑制作用比底物BDMC更強(qiáng)。本項(xiàng)目研究結(jié)果表明華根霉Rhizopuschinensis對(duì)BDMC的轉(zhuǎn)化以糖苷化反應(yīng)為主，所獲得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物BDMC-O-glucoside有更大的極性和水溶性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用較底物顯著提高，且轉(zhuǎn)化產(chǎn)率可達(dá)到63%(以峰面積計(jì)算)，提示BDMC-O-glucoside在功能性食品、醫(yī)藥領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景。

活性天然產(chǎn)物作為預(yù)防和治療疾病的有效手段，近年來已經(jīng)成為醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，然而中藥及普通植物中的天然活性成分含量往往偏低，如紫杉醇、人參皂苷等成分在植物中含量?jī)H為萬分之幾或更低[13]，這一特性使得從中藥及普通植物提取物中獲得大量活性天然產(chǎn)物非常困難。此外，天然產(chǎn)物復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其化學(xué)合成及結(jié)構(gòu)修飾的反應(yīng)難度大、反應(yīng)過程復(fù)雜，成本較高，也不適用于天然產(chǎn)物的合成和結(jié)構(gòu)改造。以微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)為先導(dǎo)建立的植物生物轉(zhuǎn)化法，是利用植物組織或植物中的酶系進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化，具有低成本、反應(yīng)溫和、污染小等特點(diǎn)，并且有較高的選擇性，能夠完成化學(xué)合成反應(yīng)難以完成的反應(yīng)。生物轉(zhuǎn)化技術(shù)不僅能夠改變中藥的主要活性成分含量、活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)，還能夠?qū)τ卸局兴庍M(jìn)行增效減毒，在天然藥物的創(chuàng)新研發(fā)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用空間[14-15]。目前，已經(jīng)對(duì)于黃酮類成分、蟾蜍甾烯類成分、萜類化合物及生物堿類成分都已進(jìn)行了較為系統(tǒng)的生物轉(zhuǎn)化研究[16-17]。隨著技術(shù)的進(jìn)步，生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在食品工業(yè)領(lǐng)域的發(fā)展?jié)摿薮蟆１疚慕榻B的基于華根霉素對(duì)姜黃素類成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲得糖苷化產(chǎn)物的方法對(duì)活性天然產(chǎn)物的深入開發(fā)具有極強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)

[1]韋星船, 杜志云, 涂增清，等. 姜黃素衍生物與類似物的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用,2010, 22 (5): 527-538.

[2]仲明遠(yuǎn), 全山叢, 胡晉紅, 姜黃素制劑學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中成藥,2007, 29 (2): 255-258.

[3]ANAND P, THOMAS S G, KUNNUMAKKARA A B, et al. Biological activities of curcumin and its analogues (congeners) made by man and mother nature[J]. Biochemical Pharmacology,2008, 76 (11): 1 590-1 611.

[4]MOHRI K, WATANABE Y, YOSHIDA Y, et al. Synthesis of glycosylcurcuminoids[J]. Chemical Pharmaceutical Bulletin,2003,51 (11): 1 268-1 272.

[5]ITOKAWA H, MORITA H, MIDORIKAWA I, et al. Diarylheptanoids from the rhizome of Alpinia officinarum Hance[J]. Chemical Pharmaceutical Bulletin,1985, 33 (11): 4 889-4 893.

[6]ZHAO Jun, GUAN Shu-hong, CHEN Xiao-bin, et al. Two new compounds derived from bufalin[J]. Chinese Chemical Letters,2007, 18 (11): 1 316-1 318.

[7]DAI Jun-gui, QU Run-Jiang, ZOU Jian-hua, et al. Structural diversification of taxanes by whole-cell biotransformation[J]. Tetrahedron,2008, 64 (35): 8 102-8 116.

[8]JIANG Hong-liang, SOMOGYI A, JACOBSEN N E, et al. Analysis of curcuminoids by positive and negative electrospray ionization and tandem mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2006a, 20 (6): 1 001-1 012.

[9]AGGARWAL B B, KUMAR A, BHARTI A C. Anticancer potential of curcumin: Preclinical and clinical studies[J]. Anticancer Research, 2003, 23 (1A): 363-398.

[10]RAMSEWAK R S, DEWITT D L, NAIR M G, et al. Cytotoxicity, antioxidant and anti-inflammatory activities of curcumins Ⅰ-Ⅲ fromCurcumalonga[J]. Phytomedicine, 2000, 7(4): 303-307.

[11]李劍明，楊和平，劉松青. 3種姜黃色素單體抑制人內(nèi)皮細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2002, 31(9): 804-805.

[12]KAMINAGA Y, NAGATSU A, AKIYAMA T, SUGIMOTO N, et al. Production of unnatural glucosides of curcumin with drastically enhanced water solubility by cell suspension cultures ofCatharanthusroseus[J]. FEBS Letters, 2003, 555(2): 311-316.

[13]賀賜安，余旭亞，孟慶雄, 等. 生物轉(zhuǎn)化對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012, 24(5): 843-847.

[14]邱海龍，陳建偉，李祥. 生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥，2012, 14 (2): 3-7.

[15]王煜丹，程桂廣，余旭亞，等. 生物轉(zhuǎn)化對(duì)天然產(chǎn)物化學(xué)中的研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)與生物工程，2010, 27(2): 7-10.

[16]崔莉，孫娥，陳玲玲，等. 生物轉(zhuǎn)化在黃酮類化合物中的研究與應(yīng)用[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2013,28(3): 764-767.

[17]馬驍馳，果德安.中藥活性成分生物轉(zhuǎn)化的研究思路與方法[J]. 中國(guó)天然藥物，2007, 5(3): 162-168.

The preparation of bisdemethoxycurcumin-glucoside by microbial transformation method and its inhibitory effect to HepG2 Tumor cells

LI Rui1*, LIU Fan1, LI Yun-xiang1, JIA Kun1, ZHANG Xiu-mei1, XU Wei1,SU Guo-long1, HUANG Wei-wei1, LUO Jing-wen2

1(School of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039,China)2(West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

ABSTRACTBisdemethoxycurcumin is a nature-derived phenolic compound with potent anti-oxidant and anti-tumor activities. However, the application of bisdemethoxycurcumin in food and medicine industry was restricted by its poor solubility and stability. The introduction of glucoside bond by microbial transformation method to improve the water solubility through structural transformation is an effective way. In this paper, the transformation of bisdemethoxycurcumin by different microbial strains was studied. It was found that bisdemethoxycurcumin could be transformed to bisdemethoxycurcumin-glucoside by Rhizopus chinensis IFFI 3043, and the conversion rate was up to 63%. The chemical structure of bisdemethoxycurcumin-glucoside was confirmed by HPLC-MS and NMR methods. The analysis on dynamic curve of transformation was also completed. It was also discovered that the inhibitory effect of bisdemethoxycurcumin-glucoside on HepG2 tumor cells was stronger than that of bisdemethoxycurcumin by MTT method. The microbial transformation method established in this paper could have great potential in functional food and medicine industry.

Key wordsbisdemethoxycurcumin; Rhizopus chinensis; microbial transformation; glucoside; anti-tumor

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606004

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81302742);教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目(13205638);四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(11ZA005)

收稿日期：2016-01-04，改回日期：2016-02-25

第一作者：博士研究生，副教授(本文通訊作者,E-mail: lirui-elite@163.com)。