張慧，楊勝利

（1浙江省質量檢測科學研究院，浙江杭州 310018；2浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州 310014）

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·科技論文·

超聲波轉化方法將外源性質粒導入甾短桿菌的研究

張慧1，楊勝利2

（1浙江省質量檢測科學研究院，浙江杭州 310018；2浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州 310014）

摘要:目的:建立甾短桿菌的高效超聲波轉化方法，為利用甾短桿菌重組表達功能基因提供方法基礎。方法∶采用超聲波誘導的方法把外源DNA轉化進甾短桿菌基因組中。通過對甾短桿菌生長狀態(tài)，超聲波作用條件等影響因素進行探索。結果∶當采用OD600為0.7的菌體制備感受態(tài)細胞、超聲波強度為400W、作用時間為40min和質粒濃度為0.2 g/L時，轉化效率達到最大值，為384個轉化子/ μg DNA。經抽樣PCR鑒定所得到的轉化子均為陽性克隆。結論通過優(yōu)化超聲波轉化條件，從而獲得了高效電轉化技術方法。

關鍵詞：甾短桿菌；超聲波；轉化率

近年來由于功率超聲設備的普及和發(fā)展，超聲波對生物反應過程的影響正引起人們強烈的興趣和高度重視。研究表明：合適強度的超聲波作用于生物反應培養(yǎng)液，可增強基因轉移效率，增加細胞膜的通透性和選擇性，促進酶的分泌，增強細胞的代謝作用，從而，能縮短反應時間，提高產品質量和產量。如在乳酸發(fā)酵過程中，采用超聲波處理可以提高發(fā)酵效率［1，2］。在酵母產酒精的研究中也取得了相類似的效果［3，4］，并且在提高乙醇產量的同時，對酵母生長也起到促進作用［5］。盡管利用超聲波作用生物反應過程的研究有所報道，但是多集中在乳酸發(fā)酵和乙醇發(fā)酵，超聲促進微生物轉化技術研究國內外未見文獻報道。本項目擬利用超聲波誘導攜帶膽固醇氧化酶基因的質粒分別插入甾短桿菌細胞，以期獲得高產膽固醇氧化酶的菌株，并建立超聲波誘導基因轉化的新方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質粒

膽固醇氧化酶生產菌（Brevibacterium sp.），由本實驗室篩選并保存；質粒pET28a-choB，由本實驗室自行構建。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（蛋白胨∶10g，酵母提取物∶5g，氯化鈉∶10g，水：1L）。

1.1.3主要試劑和儀器

超聲波（定制）無錫雷士超聲波設備有限公司；ABI公司2720型PCR儀；ALPHA2200 Imager凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2感受態(tài)細胞的制備

菌種于LB培養(yǎng)基中，200r/min，30℃振蕩培養(yǎng)一定時間，12000r/min，10min，4℃離心收集細胞，制備超聲波轉化感受態(tài)細胞。

1.3大腸桿菌超聲波轉化方案

超聲波轉化中，取40μL的甾短桿菌感受態(tài)細胞，加入適量質粒（質粒濃度100ng/μL）；二甲基亞砜作為緩沖液，調至質量分數(shù)1%；溫度調至30℃；pH調至7.0；超聲波場強為200～500W，處理時間為20～50min。

1.4陽性轉化子的篩選和鑒定

當轉化結束后，將轉化后的菌液涂布到含Kan和Cam的LB平板上進行篩選，隨機選取轉化平板上的轉化子提取基因組DNA，以其為模板，采用特異性引物進行PCR驗證。所用引物：5'-TTCCATGGCC?GATAGCCGGGCGAACAG-3'和 5'-GCGAATTCT?CACTGGATGTCGGACGAGATGA-3'。PCR反應條件為∶94℃5 min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃5min。凝膠電泳檢測重組載體是否插入甾短桿菌基因組。

1.5誘導表達

挑取陽性克隆單菌落并接種于4mL含有濃度為50μg／mL Cam和50μg／mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，于30℃，200r／min震蕩過夜。取1mL培養(yǎng)物，將其轉接于50mL含有濃度為50μg／mLCam和50μg／mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中30℃、200 r／min震蕩培養(yǎng)至菌體濃度OD600約為0.7。向培養(yǎng)物中加入1mmoL／L的IPTG誘導培養(yǎng)。收集菌體供電泳分析及酶活力測定。

1.6菌體破碎

12，000r／min，4℃離心5 min收集菌體后，用50mmol/L的pH7.5的磷酸洗滌懸浮菌體，超聲波破碎儀500w，工作10s，間歇5s，99個循環(huán)，破碎菌體。4℃12，000r／min離心15 min去除細胞碎片沉淀，取上清酶活分析。

1.7酶活力測定

3mL溶液A（疊氮鈉，0.2g/L；4-氨基-安替比林，1mmoL／L；苯酚，6mmoL／L；過氧化物酶，5，000U／L；磷酸鉀緩沖液，25mmoL／L，pH7.5），150μL溶液 B（膽固醇，8.26g/L；Triton X-100，4.26%；異丙醇為溶劑），50μL酶液，37℃，反應5min，沸水浴3min，于500nm測吸光值。酶活（U／mL）= 1.6832×A500。

酶活力單位定義：37℃，1min轉化1μmol膽固醇生成膽甾-4-烯-3-酮的酶量定義為1個酶活單位（U）。

2　結果

2.1甾短桿菌不同生長時期對轉化效率的影響

細胞能夠從周圍環(huán)境中攝取DNA分子，并且不易被細胞內的限制性核酸內切酶分解時所處的一種特殊生理狀態(tài)稱稱為感受態(tài)。為確定甾短桿菌制備感受態(tài)細胞的最佳生長時期，分別在甾短桿菌培養(yǎng)OD600值為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8后，制備感受態(tài)細胞，將不同生長時期制備的感受態(tài)細胞與100ng的質粒DNA在300W的超聲場強度下進行超聲波轉化。實驗結果表明：OD600值為0.7培養(yǎng)物制備的感受態(tài)細胞超聲波轉化效率最高，能達到241個轉化子/μgDNA（圖1）。

圖1　不同生長時期甾短桿菌的超聲波轉化效率

2.2超聲波強度對轉化效率的影響

圖2　超聲波強度對轉化效率的影響

100ng質粒DNA加入OD600值為0.7的甾短桿菌感受態(tài)細胞，分別在200W、250W、300W、350W、400W、450W和500W的7種不同超聲場強度下進行轉化。結果見圖2，在400W的電場強度下的電轉化效率最高可達289個轉化子/μg DNA。當超聲場強度超過400W時超聲轉化效率隨著超聲場強度增大而逐漸降低。

2.3超聲波作用時間對轉化效率的影響

固定甾短桿菌培養(yǎng)OD600值為0.7，超聲場強度為400W，細胞分裝體積為40μL，預轉化的質粒為0.1μg，分別選取超聲波時間，設置不同水平進行超聲波轉化試驗，結果見圖3。超聲波處理時間為40min時轉化效率最高為356個轉化子/μgDNA），隨著超聲波處理時間的延長，轉化效率增加，當超聲波處理時間超過40min時，轉化效率開始下降。

圖3　超聲波處理時間對轉化效率的影響

2.4DNA濃度對轉化效率的影響

采用上述優(yōu)化的實驗條件，大腸桿菌經培養(yǎng)OD600值為0.7后制備感受態(tài)細胞，分別加入不同量的質粒DNA，在400W的超聲場強度下進行超聲轉化。結果見圖4，DNA量在0.01～1μg，轉化效率隨DNA量的增加而迅速增加，當DNA量達到0.2g/L時，轉化效率增加趨勢趨于平緩，達到384個轉化子/μgDNA。

圖4　質粒濃度對轉化效率的影響

2.5大腸桿菌超聲波轉化子的檢測和分析

由于質粒pET28a-choB攜帶膽固醇氧化酶基因，故轉化成功的陽性克隆可以將其周圍培養(yǎng)基中的膽固醇轉化成膽甾-4-烯-3-酮，從而使菌落周圍出現(xiàn)透明圈。隨機挑取具有透明圈的菌落，擴大培養(yǎng)，提取質粒后用酶切質粒，進行核酸凝膠電泳，結果見圖5。由圖5可知，轉化質粒大小接近于1700 bp，與膽固醇氧化酶基因大小一致，說明轉化成功。

圖5　轉化子的PCR驗證

2.6酶活鑒定及穩(wěn)定性研究

按照“材料與方法”所述，在添加了適當濃度抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)陽性轉化子至菌體濃度OD600為0.7左右時，向培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度為1mmol／L，誘導培養(yǎng)4h。收集菌體，破碎細胞后，測定酶活力。同時以Brevibacterium sp.，未經IPTG誘導的陽性轉化子為對照分別測定酶活力，酶活測定結果見表1。

表1　膽固醇氧化酶活力測定結果

為檢測質粒pET28a-choB在超聲波轉化甾短桿菌轉化子中的遺傳穩(wěn)定性，將轉化子在不含Kan和Cam的LB平板上連續(xù)轉接3次，隨機挑取100個單菌落轉接到Kan和Cam的LB平板上，未發(fā)現(xiàn)抗性消失的菌落。隨機選取5個菌落，經PCR擴增和測序驗證，結果與超聲波轉化子驗證一致。表明pET28a-choB質粒能在甾短桿菌中穩(wěn)定遺傳。

參考文獻：

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Study on exogenous plasmids transformed into Brevibacterium sp. by ultrasonic

ZHANG Hui1，YANG Sheng-li2
（1Zhejiang Institute of Quality Inspection Science，Hangzhou Zhejiang 310018；
2The College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou Zhejiang 310014）

Abstract:Objective∶A high efficient method of ultrasonic transformation was established to provide the basis for expressing the functional genes in Brevibacterium sp.Methods∶The method used to extraneous DNA was transformed into Brevibacterium sp.genome by ultrasonic transformation.The main factors that affect the transformation efficiency were explored and optimized.Results∶The optimal conditions for ultrasonic transformation of Brevibacterium sp.were obtained with the maximum transformation efficiency of 384 transformants/μg plasmid DNA when the Brevibacterium sp.cells of OD600 to 0.7 were used for competent cells，and the ultrasonic treatment were under the conditions of field intensity of 400W，40min and 0.2 g/L plasmid DNA.All the transformants were confirmed to be positive clones.Conclusion The highly effective transformation technique was obtained through optimizingthe ultrasonic transformation conditions.

Keywords:brevibacterium sp.；ultasonic；transformation efficiency

doi：10.3969/j.issn.1008-1267.2016.01.007

中圖分類號：R965.2

文獻標志碼：A

文章編號：1008-1267（2016）01-0019-04

收稿日期：2015-09-06

基金項目：浙江省科技廳公益項目（2014C32034）

通信作者：楊勝利（1972-），男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。