黨同學(xué),張慶慶,湯文晶,程亞運(yùn)

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

?

ARTP誘變篩選匍枝根霉提高木聚糖酶活力研究

黨同學(xué),張慶慶?,湯文晶,程亞運(yùn)

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

摘要:以匍枝根霉亞種點(diǎn)頭根霉TP-02為原始菌株,利用ARTP誘變系統(tǒng)進(jìn)行誘變處理．通過(guò)透明圈法進(jìn)行初篩和搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩,獲得一株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)木聚糖酶誘變菌株TZD-01,木聚糖酶活力達(dá)到280．81 U/m L,為原始菌株的2．7倍．通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察誘變菌株與原始菌株微結(jié)構(gòu)特征變化,ARTP誘變處理可引起菌株形態(tài)特征發(fā)生改變．誘變菌株的菌落形態(tài)不規(guī)則,顏色為黑褐色,比原始菌株偏深;菌絲直徑變大,形態(tài)更飽滿;孢子形態(tài)規(guī)則更接近圓形,誘變篩選菌株的生長(zhǎng)速度比原始菌株更快．

關(guān) 鍵 詞:ARTP;匍枝根霉;木聚糖酶;掃描電子顯微鏡

木聚糖酶[1]主要由β-1,4-D-外切木糖苷酶和β-1,4-D-內(nèi)切木聚糖酶構(gòu)成,是能降解木聚糖為木糖和木寡糖的一組酶的總稱．目前在食品、生物漂白、生物制漿、飼料等方面木聚糖酶使用廣泛[2]．以匍枝根霉亞種點(diǎn)頭根霉TP-02為出發(fā)菌株,該菌株具有生長(zhǎng)周期短、不易染菌等特點(diǎn),有利于誘變篩選出高產(chǎn)木聚糖酶菌株．利用ARTP[3]技術(shù)對(duì)該匍枝根霉進(jìn)行誘變處理,誘變條件為通氣量10 L/min、功率100 W、等離子體發(fā)射源與樣品之間距離為2 mm．經(jīng)過(guò)篩選得到一株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)木聚糖酶菌株,用電子顯微鏡和掃描電鏡觀察誘變篩選后菌株與原始菌株微結(jié)構(gòu)特征變化,從而可提供一種從匍枝根霉誘變篩選高活力木聚糖酶的方法．

1 材料與方法

1．1 菌株與試劑

微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心提供的匍枝根霉亞種點(diǎn)頭根霉TP-02;木聚糖為樺木木聚糖, Sigma公司;其他試劑均為分析純．

1．2 試驗(yàn)儀器與培養(yǎng)基

思清源生物科技有限公司ARTP誘變育種機(jī);日立S-4800掃描電子顯微鏡(SEM)．

固體斜面培養(yǎng)基(PDA):葡萄糖20 g、瓊脂20 g、馬鈴薯200 g、水1 L、自然p H;此培養(yǎng)基用于菌種保存和傳代培養(yǎng)．

初篩平板培養(yǎng)基(g/L):瓊脂20．0、NH4NO32．0、酵母膏5．0、MgSO4·7H2O 0．2、木聚糖10．0、K2HPO42．0、p H 7．2;此培養(yǎng)基用于菌種的透明圈測(cè)定[4]．

復(fù)篩培養(yǎng)基:10%麥麩浸出汁,p H自然．

復(fù)篩擴(kuò)大培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基):麥麩2%、玉米芯2%、(NH4)2SO40．3%、KH2PO40．2%、MgSO4· 7 H2O 0．2%、CaCl2 0．4%、吐溫－80 0．05%,p H自然．

1．3 孢子懸浮液的制備

在無(wú)菌操作臺(tái)中用無(wú)菌水從斜面上洗下孢子,經(jīng)過(guò)棉花、漏斗進(jìn)行過(guò)濾,在濾液中加入玻璃珠,搖床震蕩2 h后,將梯度稀釋后的孢子懸浮液分別滴到血球計(jì)數(shù)板上,通過(guò)顯微鏡記錄孢子個(gè)數(shù),按照血球計(jì)數(shù)板規(guī)格進(jìn)行計(jì)算,將匍枝根霉菌株誘變前孢子懸浮液濃度稀釋到106～107個(gè)/m L．

1．4 ARTP誘變和篩選方法

以1．3方法調(diào)整孢子懸浮液濃度,按照ARTP誘變系統(tǒng)的操作流程,以氦氣作為工作氣體,誘變條件為通氣量10 L/min、功率100 W、等離子發(fā)射端與孢子懸浮液距離為2 mm,以誘變處理時(shí)間為可變參數(shù),改變誘變處理時(shí)間可獲得匍枝根霉菌株適宜的誘變條件[5],分別設(shè)定0、60 s、120 s、180 s、240 s、270 s、300 s、330 s、360 s為處理時(shí)間．誘變處理后的孢子懸浮液進(jìn)行后培養(yǎng),振蕩形成新的菌懸液,在無(wú)菌操作臺(tái)中分別進(jìn)行梯度稀釋,取100μL稀釋液涂布平板,30℃培養(yǎng)48 h記錄菌落數(shù),并計(jì)算致死率:

致死率＝(U－T)/U×100%

式中,U為誘變前生長(zhǎng)的菌落數(shù);T為誘變后生長(zhǎng)的菌落數(shù)．

初篩:匍枝根霉菌株孢子懸浮液經(jīng)過(guò)ARTP誘變后,進(jìn)行適當(dāng)梯度稀釋,分別在稀釋后的孢子懸浮液中吸取100 u L,涂布到含有木聚糖的篩選培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48 h,采用剛果紅法進(jìn)行染色．通過(guò)透明圈法對(duì)誘變后菌株進(jìn)行篩選,然后挑選出透明圈直徑比菌落直徑比值較大菌落進(jìn)行復(fù)篩[6]．

復(fù)篩:在復(fù)篩培養(yǎng)基中接入初篩所得菌株,30℃、180 r/min培養(yǎng)24 h,再轉(zhuǎn)接入復(fù)篩擴(kuò)大培養(yǎng)基中,接種量10%、30℃、180 r/min培養(yǎng)5 d后測(cè)定酶活．

1．5 木聚糖酶活力測(cè)定

木聚糖酶活力的測(cè)定采用DNS法[7]．將發(fā)酵液在4℃、800 0 r/min的離心管中離心10 min,離心后取上清液作為粗酶液．520 nm處測(cè)定其吸光度,酶活力定義:在50℃、p H 4．6下,每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生1 umol木糖所需的木聚糖酶量為1個(gè)單位酶活力(U)．實(shí)驗(yàn)用DNS法測(cè)吸光值時(shí),保持測(cè)得的吸光值在0．2～0．8之間．

1．6 匍枝根霉產(chǎn)木聚糖酶遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

選育出高產(chǎn)突變株后,對(duì)其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究,進(jìn)行10次傳代培養(yǎng),并分別測(cè)定木聚糖酶活性．

取相同條件下培養(yǎng)的匍枝根霉誘變菌株和原始菌株平板進(jìn)行試驗(yàn),從平板上用接種環(huán)分別刮下少許匍枝根霉的菌絲,用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色,染色后進(jìn)行制片,光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài);從平板上用接種環(huán)分別刮下少許匍枝根霉的菌絲,置于滴有無(wú)菌水的蓋玻片,進(jìn)行固定,將固定好的菌體樣品置于樣品臺(tái)上,用離子鍍膜儀進(jìn)行噴金,再用掃描電鏡進(jìn)行觀察．

1．8 突變菌株與原始菌株發(fā)酵對(duì)比

以原始菌株作為對(duì)照,將誘變篩選的突變菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng),3組平行試驗(yàn),每天測(cè)定酶活取平均值,并進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比,結(jié)果如表1所示．

表1 突變菌株與原始菌株發(fā)酵酶活力對(duì)比

圖1 ARTP處理的匍枝根霉TP-02致死率曲線

2 結(jié)果與分析

2．1 致死率曲線

按照1．4方法利用CFU計(jì)算菌株的致死率,繪制出致死率曲線[8],結(jié)果如圖1所示．由圖1可知,隨處理時(shí)間的延長(zhǎng),ARTP對(duì)匍枝根霉TP-02菌株的致死率明顯增加．誘變處理180 s時(shí),致死率超過(guò)85%;誘變處理240 s時(shí),致死率達(dá)到93%;當(dāng)誘變處理時(shí)間為360 s 時(shí),致死率趨近100%．誘變處理致死率在90%左右時(shí),誘變處理的效果較好[9],因此,采用240 s作為誘變處理時(shí)間,對(duì)匍枝根霉TP-02菌株進(jìn)行誘變,此時(shí)的誘變致死率為93%．

2．2 初篩

按照1．4初篩的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),采用透明圈法進(jìn)行初篩,其中以H/D作為比值,H代表透明圈直徑, D代表菌落直徑,初篩獲得32株菌株,結(jié)果如表2所示．

表2 初篩結(jié)果

2．3 復(fù)篩

第二，特色農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量無(wú)法保障，售后機(jī)制不完善。通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)銷售特色農(nóng)產(chǎn)品，不是簡(jiǎn)單的銷售渠道的方面，更重要的是保證消費(fèi)者收到質(zhì)量高的農(nóng)產(chǎn)品。很多消費(fèi)者在進(jìn)行區(qū)域特色農(nóng)產(chǎn)品購(gòu)買(mǎi)時(shí)候，當(dāng)產(chǎn)品送達(dá)時(shí)，產(chǎn)品出現(xiàn)過(guò)期、與特色農(nóng)產(chǎn)品不符等狀況，同時(shí)，還無(wú)法便利進(jìn)行售后，對(duì)平臺(tái)造成不利影響。所以，要制定嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，加大檢查與執(zhí)法力度，平臺(tái)應(yīng)不斷完善相應(yīng)的售后機(jī)制，提升消費(fèi)者獲得感、幸福感。

突變菌株與原始菌株相對(duì)突變比值如圖2所示．由圖2可知,出發(fā)菌株匍枝根霉TP-02經(jīng)ARTP誘變處理,初篩出H/D比值較大的32株菌株進(jìn)行復(fù)篩,每組搖瓶做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),取酶活平均值．相同條件下,突變菌株酶活比上原始菌株酶活,所得比值即為相對(duì)突變比值,大于1為正突變,小于1為負(fù)突變,獲得5株(編號(hào)為10、17、24、27、30)相對(duì)突變比值較大的突變菌株,分別命名為T(mén)ZD-1、TZD-2、TZD-3、TZD-4、TZD-5．

圖2 突變菌株與原始菌株相對(duì)突變比值

2．4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

對(duì)獲得的5株突變菌株進(jìn)行連續(xù)10次傳代培養(yǎng),每代進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并測(cè)定木聚糖酶活力,原始菌株作為對(duì)照組,獲得一株遺傳穩(wěn)定的誘變菌株,遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)如圖3所示．

圖3 突變菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2．5 ARTP誘變處理引起匍枝根霉菌落形態(tài)、色澤變化

誘變前后菌落的形態(tài)如圖4所示．圖4a為誘變后菌株TZD-01平板菌落形態(tài),圖4b為相同條件下原始菌株菌落形態(tài)．由圖4可知,誘變后的菌株菌落形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則,橢圓形菌落數(shù)量比原始菌株少,菌落直徑比原始菌株大,色澤偏黑褐色,48 h已經(jīng)形成較多褐色的孢子,由此說(shuō)明誘變后的菌株生長(zhǎng)速度加快．

圖4 誘變前后菌落形態(tài)

2．6 400倍光學(xué)顯微鏡下觀察誘變前后匍枝根霉孢子囊形態(tài)變化

400倍光學(xué)顯微鏡下匍枝根霉誘變前后孢子囊形態(tài)如圖5所示．匍枝根霉形成孢子囊,囊內(nèi)細(xì)胞質(zhì)分裂形成多數(shù)孢子,孢子成熟后變?yōu)楹诤稚?、橢圓形,當(dāng)孢子囊壁破裂時(shí),孢子即散出．圖5a和圖5c為誘變后菌株孢子囊,圖5b和圖5d為相同條件下原始菌株孢子囊．由圖5可知,從形態(tài)上觀察,孢子囊均為橢圓形、呈多核狀態(tài),誘變后菌株孢子囊更偏圓形,且生長(zhǎng)速度比原始菌株快,24 h孢子囊已成熟,孢子變?yōu)楹诤稚?開(kāi)始有孢子散出．

圖5 400倍光學(xué)顯微鏡下匍枝根霉誘變前后孢子囊形態(tài)

2．7 掃描電鏡下觀察匍枝根霉菌體誘變前后形態(tài)變化

匍枝根霉特征是具有細(xì)長(zhǎng)菌絲、不分隔,菌絲初期為白色,后轉(zhuǎn)為灰色或褐色,誘變前后菌株掃描電鏡圖如圖6所示．圖6b、圖6e、圖6g、圖6i為原始菌株掃描電鏡圖．由圖6a、圖6b可知,菌絲粗細(xì)均勻、形態(tài)飽滿、筆直,直徑約6～15μm;誘變后菌株菌絲直徑稍大,孢子大多為橢圓形,稍有凹陷,直徑約2～4μm．誘變后菌株菌絲附著孢子數(shù)量明顯比原始菌株多,形態(tài)更接近橢圓,說(shuō)明誘變后菌株生長(zhǎng)更快,孢子發(fā)育更好;由圖6c、圖6d、圖6e可以清楚觀察到孢子囊的形態(tài)為橢圓形,含有大量孢子,圖6c比圖6e的孢子囊發(fā)育要成熟,已經(jīng)開(kāi)始有大量孢子散出,孢子囊周圍出現(xiàn)許多散開(kāi)的孢子,圖6d比圖6e的孢子囊更偏向橢圓,周圍散落的孢子也偏多,說(shuō)明誘變后菌株孢子囊成熟時(shí)間縮短;由圖6f、圖6h與圖6g、圖6i可知菌絲筆直、粗細(xì)較均勻,說(shuō)明誘變后篩選菌株菌絲生長(zhǎng)良好,遺傳性狀穩(wěn)定．

2．8 突變菌株與原始菌株發(fā)酵對(duì)比

突變菌株與原始菌株發(fā)酵對(duì)比如圖7所示．由表1和圖7可以看出,在發(fā)酵第1 d時(shí)突變菌株酶活力為40．18 U/m L,原始菌株酶活力31．39 U/m L,兩者酶活力大小相差不多;但從第2 d開(kāi)始突變菌株酶活力達(dá)到90．27 U/m L,較原始菌株酶活力42．81 U/m L大小顯著增加,比原始菌株酶活力增加速率高;到第4 d時(shí)酶活力大小開(kāi)始緩慢增加,第5 d時(shí)達(dá)到最大值,與原始菌株一致,然后突變菌株酶活力開(kāi)始下降;突變菌株在第5 d時(shí)最大酶活力達(dá)280．81 U/m L,是原始菌株的2．7倍,該菌株遺傳穩(wěn)定性較好,有利于進(jìn)一步優(yōu)化提高木聚糖酶活力．

3 結(jié)論

通過(guò)ARTP誘變處理匍枝根霉TP-02菌株,利用透明圈法進(jìn)行初篩和搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩,獲得一株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)木聚糖酶菌株TZD-01．該菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),5 d后測(cè)木聚糖酶活力可達(dá)到280．81 U/m L,為匍枝根霉誘變前菌株的2．7倍．利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察誘變篩選后菌體與原始菌株微結(jié)構(gòu)特征變化,ARTP誘變處理匍枝根霉可引起菌株形態(tài)特征改變．誘變后篩選的突變菌株的菌落色澤變深偏黑褐色,形態(tài)不規(guī)則;菌絲直徑比誘變前菌株大,形態(tài)更飽滿;孢子形態(tài)比誘變前菌株規(guī)則,更接近橢圓,誘變篩選菌株的生長(zhǎng)速度比原始菌株快．ARTP等離子體發(fā)射均勻,能夠產(chǎn)生穿過(guò)細(xì)胞膜的活性粒子,進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)部對(duì)遺傳物質(zhì)造成損傷,導(dǎo)致基因發(fā)生突變[8]．在通氣量10 L/min、功率100 W、等離子發(fā)射端與孢子懸浮液距離為2 mm條件下,通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定匍枝根霉ARTP合適的誘變時(shí)間為240 s,可為進(jìn)一步研究ARTP誘變篩選匍枝根霉產(chǎn)木聚糖酶提供參考．

圖6 掃描電鏡下匍枝根霉菌體誘變前后形態(tài)

圖7 突變菌株與原始菌株發(fā)酵對(duì)比

參考文獻(xiàn):

[1] 方微,單玉萍,李峰,等．木聚糖酶的作用機(jī)理及其在飼料中的應(yīng)用[J]．中國(guó)飼料,2011(21):21-24．

[2] K Taneja,S Gupta,R C Kuhad．Properties and application of a partially purified alkaline xylanase from an alkalophilic fungus aspergillus nidulans KK-99[J]．Bioresource Technology,2002,85(1):39-42．

[3] 祁田甜,張嬋,胡濟(jì)美,等．常壓室溫等離子體誘變技術(shù)選育高產(chǎn)Monacolin K紫色紅曲霉突變株[J]．食品科學(xué),2015, 36(9):66-70．

[4] 彭園花,盧紅梅,曾祥欽．高產(chǎn)木聚糖酶菌株的誘變篩選及其產(chǎn)酶性質(zhì)[J]．釀酒科技,2006(10):34-36．

[5] 艾江寧,姚長(zhǎng)洪,孟迎迎,等．生長(zhǎng)速度快且油脂產(chǎn)率高的湛江等鞭金藻誘變株的篩選[J]．微生物學(xué)通報(bào),2015,42(1): 142-147．

[6] 楊穎,玉王寧,金一,等．常壓室溫等離子體快速誘變綠色糖單孢菌篩選木聚糖酶高產(chǎn)菌株及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J]．微生物學(xué)通報(bào),2013,40(5):905-915．

[7] M J Bailey,P Biely,K Poutanen K．Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity[J]．Journal of Biotechnology,1992,23(3):257-270．

[8] 蔡友華,李文鋒,盧偉寧,等．新型常壓室溫等離子體(ARTP)快速誘變高產(chǎn)蘇氨酸的突變株[J]．現(xiàn)代食品科技,2013, 29(8):1 888-1 892．

[9] 薛剛,陳利娟,吳斌,等．ARTP誘變選育高溫蛋白酶高產(chǎn)菌株及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J]．食品工業(yè)科技,2015,36(1):177-180．

Study on mutagenesis and screening by ARTP for improving Rhizopus stolonifer xylanase activity

DANG Tong-xue,ZHANG Qing-qing?,TANG Wen-jing,CHENG Ya-yun
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Abstract:With Rhizopus stolonifer subspecies nod Rhizopus TP-02 as the starting strain,ARTP mutagenesis system was applied to mutagenic treatment．Primary screening by the method of transparent circle,then complex screening by shake flask fermentation,a stable xylanase producing strain TZD-01 was obtained．Xylanase activity reached 280．81 U/m L,2．7 times that of the original strain．The microstructure changes of the mutant strain and the original strain were observed by electron microscope and scanning electron microscope．ARTP mutation treatment can cause the changes of the morphological characteristics of the strain,irregular colony morphology of mutant strains,and the darker color than the original strain．After ARTP treatment,the mycelium diameter becomes larger,the shape is sounder,the spore morphology rule is closer to the circular,and the mutant strain grew faster than the original strain．

Key words:ARTP;rhizopus stolonifer;xylanase;scanning electron microscope

中圖分類號(hào):TS201．3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

收稿日期:2015-10-16

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31270135)

作者簡(jiǎn)介:黨同學(xué)(1989-),男,安徽阜陽(yáng)人,碩士研究生．

通訊作者:張慶慶(1954-),女,安徽懷寧人,教授,碩導(dǎo)．