華 駿,楊 帆,李碧玲,趙世光

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

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畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件優(yōu)化

華 駿,楊 帆,李碧玲,趙世光?

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

摘要:采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)法對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究．以單因素實(shí)驗(yàn)確定甘油、甲醇、初始p H為影響酶活的主要因素,通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化,得到畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳發(fā)酵條件:甘油濃度19．4 m L/L、硫酸銨質(zhì)量濃度15 g/L、初始p H 6．12、甲醇濃度2%、裝液量20 m L,β-葡萄糖苷酶酶活達(dá)到31．87 U/m L,比優(yōu)化前提高了162．74%．

關(guān) 鍵 詞:畢赤酵母;β-葡萄糖苷酶;發(fā)酵條件;響應(yīng)面法

β-葡萄糖苷酶(EC3．2．1．21)又稱β-D-葡萄糖苷水解酶,能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖[1]．β-葡萄糖苷酶能將果、蔬、茶中的風(fēng)味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì),可增加酒類和果汁產(chǎn)品中的風(fēng)味物質(zhì)含量,廣泛應(yīng)用于食品、飲料的增香[2]．

β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌類群廣泛分布于原核、真核、古細(xì)菌界等幾十個(gè)屬,有上百種之多[3]．目前對(duì)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌研究較多的是絲狀真菌中的曲霉屬和木霉屬、細(xì)菌中的芽抱桿菌屬．畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種真核表達(dá)系統(tǒng),克服了傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)如E．coli等表達(dá)外源蛋白過(guò)程中易形成不溶性包涵體、表達(dá)量低的缺陷．前期研究中已構(gòu)建了一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)酶的重組畢赤酵母,實(shí)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酶的異源表達(dá),但其產(chǎn)酶能力較低,亟需對(duì)其營(yíng)養(yǎng)條件及發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化控制,以實(shí)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的高效生產(chǎn)．

采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)法對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究,以單因素實(shí)驗(yàn)法分析碳源、氮源、誘導(dǎo)劑、p H、裝液量、誘導(dǎo)時(shí)間等因素對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響．在此基礎(chǔ)上,用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究．

1 材料與方法

1．1 菌種及培養(yǎng)基

重組畢赤酵母(Pichia pastoris),安徽工程大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室選育．

斜面培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、瓊脂20 g/L,p H自然;種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L,p H自然;基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基:甘油20 m L/L、(NH4)2SO410、H3PO420 m L/L、MgSO4·7H2O 2．046、K2SO41、CaCl2·2 H2O 0．216、PTM110 m L/L,p H 6．0;PTM1: CuSO4·5H2O 6、KI 0．088 6、MnSO4·H2O 3、Na MoO4·2H2O 0．2、H2BO30．02、CoCl2·6H2O 0．916、ZnCl220、FeSO4·7 H2O 65、生物素0．3、濃硫酸5 m L/L．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)培養(yǎng)方法．種子培養(yǎng):從斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌種接于裝液量為20 m L的250 m L三角搖瓶中, 在28℃、200 r/min搖床轉(zhuǎn)速的條件下培養(yǎng)24 h．產(chǎn)酶培養(yǎng):以1%的接種量將菌種接于裝液量為20 m L的250 m L三角搖瓶中,在28℃、200 r/min搖床轉(zhuǎn)速的條件下培養(yǎng)30 h后,添加1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng),3 d后測(cè)定酶活與菌體濃度．

(2)菌體濃度測(cè)定．將發(fā)酵液作適當(dāng)稀釋,用可見分光光度計(jì)于600 nm下測(cè)定吸收值(OD600)．用相同稀釋倍數(shù)的空白培養(yǎng)基作對(duì)照．測(cè)定出的數(shù)值與稀釋倍數(shù)的積即為細(xì)胞的OD600:OD600＝OD600測(cè)定值×稀釋倍數(shù)[4]．

(3)β-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定．β-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定采用4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p NPG)法．取1 m L發(fā)酵液,10 000 r/min下離心10 min后,取上清液作為粗酶液．取20μL適當(dāng)稀釋的酶液與180μL 5 mmol/L p NPG溶液混合,于50℃水浴恒溫反應(yīng)10 min后,加入2 m L 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng),在408 nm處測(cè)定反應(yīng)液吸光度[5]．以液體培養(yǎng)基的反應(yīng)混合液為對(duì)照．以1 min內(nèi)底物p NPG被水解釋放出1μmol的對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為1個(gè)酶活單位(U)．

(4)產(chǎn)酶條件優(yōu)化．以單因素實(shí)驗(yàn)分別考察碳源(葡萄糖、甘油、蔗糖、玉米漿、可溶性淀粉)、碳源濃度(1%、2%、3%、4%、5%)、氮源(酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏、硝酸鉀、硫酸銨)、氮源質(zhì)量濃度(5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L)、甲醇濃度(0．5%、1．0%、1．5%、2．0%、2．5%、3．0%)、p H(4、5、6、7、8、9)、裝液量(15 m L、20 m L、25 m L、30 m L、35 m L、40 m L)對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響,以1%的接種量將菌種250 m L三角搖瓶中,在28℃、200 r/min搖床轉(zhuǎn)速的條件下培養(yǎng)30 h后,添加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng),3 d后測(cè)定酶活與菌體濃度．對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后,確定影響β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的主要因素及其各自較優(yōu)水平,繼而采用3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步尋優(yōu)．響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示．

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2．1 碳源對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

硫酸銨質(zhì)量濃度10 g/L、初始p H 6、裝液量20 m L、培養(yǎng)溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,培養(yǎng)30 h 后,添加1%的甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)3 d,相同濃度(2%)的葡萄糖、甘油、蔗糖、玉米漿、可溶性淀粉對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響如圖1所示．由圖1可知,葡萄糖最有利于畢赤酵母的菌體生長(zhǎng),菌體濃度最高,達(dá)到了59．95,酶活達(dá)到了10．45 U/m L;而甘油最利于畢赤酵母產(chǎn)酶,酶活達(dá)到12．13 U/m L,菌體濃度僅次于葡萄糖．其他碳源獲得的菌體濃度和酶活相對(duì)都較低．

選定甘油作為最優(yōu)碳源后,進(jìn)一步考察了甘油的較優(yōu)添加濃度如圖2所示．由圖2可知,菌體濃度隨甘油添加量的增加而持續(xù)增加,甘油濃度2%時(shí)最有利于畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶,繼續(xù)提升甘油濃度則不利于產(chǎn)酶,甘油濃度超過(guò)3%后,幾乎檢測(cè)不到β-葡萄糖苷酶酶活．這可能因?yàn)榕囵B(yǎng)基中殘留有甘油時(shí),畢赤酵母在發(fā)酵經(jīng)甲醇的誘導(dǎo)作用的產(chǎn)酶代謝過(guò)程受到抑制,甚至無(wú)法產(chǎn)酶[6]．

圖1 碳源對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

圖2 甘油濃度對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

2．2 氮源對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

甘油濃度2%、初始p H 6、裝液量20 m L、培養(yǎng)溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,培養(yǎng)30 h后,添加1%的甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)3 d,相同質(zhì)量濃度(10 g/L)的酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏、硝酸鉀、硫酸銨幾種氮源對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響如圖3所示．由圖3可知,以硫酸銨作為唯一氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基最有利于畢赤酵母的產(chǎn)酶發(fā)酵,酶活最高,達(dá)到了12．03 U/m L,而酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏的酶活均很低,分別僅有0．86 U/m L、0．91 U/m L、0．18 U/m L,畢赤酵母雖然在硝酸鉀作為唯一氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基有所生長(zhǎng),但是無(wú)法產(chǎn)酶．

選定硫酸銨作為最優(yōu)氮源后,進(jìn)一步探究硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響如圖4所示．由圖4可知,隨著硫酸銨濃質(zhì)量度的增加,畢赤酵母的菌體濃度有一個(gè)明顯的下降趨勢(shì),這可能是由于過(guò)高的氮源濃度使得培養(yǎng)基中的碳氮比過(guò)低,導(dǎo)致了菌體過(guò)早的衰老自溶,菌體濃度降低．在硫酸銨質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí),酶活達(dá)到最高,為13．55 U/m L,說(shuō)明該濃度下,發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比達(dá)到產(chǎn)酶的最優(yōu)值,最有利于畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶．

圖3 氮源對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

圖4 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

2．3 甲醇濃度對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

甲醇作為畢赤酵母產(chǎn)酶的誘導(dǎo)劑和一部分的碳源物質(zhì),在合適的濃度范圍內(nèi),對(duì)菌體產(chǎn)酶有促進(jìn)作用．然而甲醇本身對(duì)菌體有一定的毒性,濃度過(guò)高反而會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶[7]．所以探究甲醇添加量對(duì)酶活的影響、找到最適的甲醇添加濃度,對(duì)提高畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力有著重要的意義．甘油濃度2%、硫酸銨質(zhì)量濃度15 g/L、初始p H 6、裝液量20 m L的情況下,考察甲醇濃度對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響如圖5所示．由圖5可知,在一定范圍內(nèi),隨著甲醇濃度的增加,酶活也隨之明顯提高,菌體濃度略有增加,當(dāng)甲醇濃度達(dá)到2%時(shí),酶活達(dá)到最高為30．97 U/m L,甲醇濃度繼續(xù)增加,酶活略有降低,菌體濃度也有所降低,說(shuō)明高濃度的甲醇對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)酶有所抑制．

2．4 培養(yǎng)基初始p H對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

不同種類的微生物的生長(zhǎng)代謝對(duì)p H的要求各有不同,對(duì)p H的耐受范圍也有所不同,控制一定的p H范圍不但可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)代謝,而且可以抑制其他雜菌的繁殖[8]．甘油濃度2%、硫酸銨質(zhì)量濃度15 g/L、裝液量20 m L、甲醇濃度2%的情況下,考察初始p H對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響如圖6所示．由圖6可知,p H為6時(shí),酶活達(dá)到最高為29．32 U/m L,隨著初始p H的繼續(xù)增加,酶活有明顯下降趨勢(shì);初始p H較低時(shí),其酶活顯著低于高初始p H的酶活,初始p H分別為4、5時(shí),所對(duì)應(yīng)的酶活僅有5．58 U/m L和7．74 U/m L,僅為最高酶活的19．03%和26．40%;菌體濃度呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)．可選p H 6為較佳初始p H．

圖5 甲醇濃度對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

圖6 初始p H對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

2．5 裝液量對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速恒定的情況下,在有限的搖瓶空間當(dāng)中,其裝液量決定了培養(yǎng)基中的溶氧(DO)情況,而發(fā)酵培養(yǎng)基中的DO值往往直接影響微生物的產(chǎn)酶活力、代謝途徑及產(chǎn)物產(chǎn)量[9]．甘油濃度2%、硫酸銨質(zhì)量濃度15 g/L、甲醇濃度2%、初始p H 6的情況下,考察甲醇濃度對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響如圖7所示．由圖7可知,隨著裝液量的增加,酶活有明顯的下降趨勢(shì),菌體濃度也略有降低,當(dāng)裝液量為20 m L時(shí),酶活達(dá)到最大值29．61 U/m L,說(shuō)明溶氧越高越有利于菌體生長(zhǎng)繁殖及其次級(jí)代謝,越有利于畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)酶．

2．6 β-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果．在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,維持氮源濃度、裝液量在各自最優(yōu)水平下,選取甘油濃度、初始p H、甲醇濃度3個(gè)因素,設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn),進(jìn)行多因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化．Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示．經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后,得到二次多項(xiàng)回歸方程為:

Y＝－1 402．283 00＋28．683 16A＋338．173 19B＋119．948 63C－0．419 84AB－0．323 85AC－5．063 30BC－0．656 33A2－26．135 54B2－20．710 00C2

圖7 裝液量對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

(2)回歸模型的方差分析．回歸模型方差分析如表3所示．從表3可以看出,模型P＝0．000 3,失擬項(xiàng)P ＝0．584 7,表明模型回歸極顯著,失擬度不顯著;相關(guān)系數(shù)R2＝0．962 3,表明相關(guān)性良好;校正相關(guān)系數(shù)＝0．913 9,說(shuō)明該響應(yīng)面91．39%的變化可以由此模型解釋,模型的擬合程度良好,實(shí)驗(yàn)誤差較小,可以用此模型對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)．模型中一次項(xiàng)A、B,二次項(xiàng)C2影響顯著(P值＜0．05);二次項(xiàng)A2、B2極顯著(P值＜0．01);一次項(xiàng)C及所有交互項(xiàng)均不顯著(P值＞0．05)．表明甘油濃度、初始p H對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶有顯著影響;而甘油濃度、初始p H及甲醇濃度之間的交互作用對(duì)其產(chǎn)酶無(wú)顯著影響．

(3)各因素對(duì)酶活影響的響應(yīng)面．甘油濃度與初始p H對(duì)酶活影響的響應(yīng)面如圖8所示．由圖8可知,在保持甲醇濃度不變的情況下,隨著甘油濃度和p H的逐漸升高,酶活也漸漸上升,到達(dá)最高點(diǎn)后又開始明顯下降,這可能是因?yàn)殡S著甘油濃度的升高,進(jìn)入誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段時(shí)的殘留甘油增加,產(chǎn)酶代謝過(guò)程受到抑制,從而導(dǎo)致酶活的下降．

甘油濃度與甲醇濃度對(duì)酶活影響的響應(yīng)面如圖9所示．由圖9可知,當(dāng)p H保持不變時(shí),一定范圍內(nèi)逐漸提高甘油濃度和甲醇濃度,酶活也隨之漸漸升高,達(dá)到最高點(diǎn)后又逐漸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)．這可能是因?yàn)殡S著甘油濃度的升高,進(jìn)入誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段時(shí)的殘留甘油增加,產(chǎn)酶代謝過(guò)程受抑制,從而導(dǎo)致酶活下降．

初始p H與甲醇濃度對(duì)酶活影響的響應(yīng)面和等高線如圖10所示．由圖10可知,保持甘油濃度不變,在一定范圍內(nèi),隨p H和甲醇濃度升高,酶活也漸漸提高,達(dá)到最高點(diǎn)后逐漸下降．這可能是因?yàn)殡S著p H的不斷上升,畢赤酵母逐漸處于堿性環(huán)境下,對(duì)其生長(zhǎng)及產(chǎn)酶代謝有較大影響,產(chǎn)酶量下降導(dǎo)致酶活降低．

(4)響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證．根據(jù)響應(yīng)面分析得到的最佳發(fā)酵條件:甘油濃度19．4 m L/L、初始p H 6．12、甲醇濃度2%．在此條件下,畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活的理論預(yù)測(cè)值為31 U/m L．在此發(fā)酵條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),β-葡萄糖苷酶的酶活平均值達(dá)31．87 U/m L,與理論值相對(duì)誤差約為2．81%．由此可見,采用該響應(yīng)面模型得到響應(yīng)面分析的優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠,具有一定實(shí)用價(jià)值．

表3 方差分析

圖8 甘油濃度與初始p H對(duì)酶活影響的響應(yīng)面

圖9 甘油濃度與甲醇濃度對(duì)酶活影響的響應(yīng)面

3 結(jié)論

通過(guò)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面分析法,對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,得到畢赤酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳發(fā)酵條件為:甘油濃度19．4 m L/L、硫酸銨質(zhì)量濃度15 g/L、初始p H 6．12、甲醇濃度2%、裝液量20 m L．在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下β-葡萄糖苷酶酶活平均值達(dá)到了31．87 U/m L,比優(yōu)化前的酶活12．13 U/m L提高了162．74%．

圖10 初始p H與甲醇濃度對(duì)酶活影響的響應(yīng)面和等高線

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Optimization ofβ-glucosidase fermentation conditions of Pichia pastoris

HUA Jun,YANG Fan,LI Bi-ling,ZHAO Shi-guang?
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Abstract:Statistical method was used to optimize the fermentation ofβ-glucosidase produced by Pichia pastoris．Glycerol methanol and initial p H were confirmed as the critical factors impacting the enzyme activity according to the results of single factor experiment．Subsequently,by using response surface methodology,the optimum condition forβ-glucosidase yielding was obtained as following:19．4 m L/L of glycerol,15 g/L of ammonium sulfate,2%of methanol with initial p H value of 6．12 and 20 m L of liquid volume．Theβ-glucosidase activity was up to 31．87 U/m L,which increased by 162．74%than that of the original．

Key words:Pichia pastoris;β-glucosidase;fermention condition;response surface methodology

中圖分類號(hào):TQ925

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

收稿日期:2015-11-24

作者簡(jiǎn)介:華 駿(1990-),男,江蘇張家港人,碩士研究生．

通訊作者:趙世光(1977-),男,安徽宿州人,副教授,博士．