閆正，任孟偉，張麗冰，布雅楠，楊照生，李揮

（1.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002； 2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050091）

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超快速液相-質(zhì)譜法同時(shí)測定液體奶和奶粉中磺胺和喹諾酮類藥物殘留*

閆正1，任孟偉1，張麗冰1，布雅楠1，楊照生1，李揮2

（1.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002； 2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050091）

摘要建立超快速液相-質(zhì)譜聯(lián)用法測定乳制品中磺胺和喹諾酮類藥物殘留的方法。試樣加入乙腈沉淀蛋白，用0.22 μm濾膜過濾，經(jīng)EndeavorsilTMC18柱分離，選用乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相。在0.05～100.00 μg/L范圍內(nèi)，17種獸藥的質(zhì)量濃度均與色譜峰面積均呈良好的線性，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.990 6～0.999 8，方法檢出限為0.05～0.10 μg/kg，加標(biāo)回收率為75.88%～116.00%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～13%（n=5）。該方法快速、靈敏，可以滿足對乳制品中多種獸藥殘留的快速檢測要求。

關(guān)鍵詞超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；磺胺；喹諾酮類；殘留

磺胺類（SAs）和喹諾酮類（QNs）藥物均為廣譜抑菌藥，因具有抗菌譜廣、高效、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在畜牧水產(chǎn)等養(yǎng)殖生產(chǎn)中廣泛使用［1］?；前奉愃幬锸侨斯ず铣傻木哂袑Π被交酋０方Y(jié)構(gòu)的一類抗菌藥物的總稱［2］，喹諾酮類是具有1，4-二氫-4-氧代喹啉-3-羧酸結(jié)構(gòu)的人工合成抗菌藥物?；前奉惡袜Z酮類藥物均具有抗原性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性菌株甚至誘發(fā)癌癥。有些養(yǎng)殖戶法律意識(shí)淡薄，擅自加大用藥量，不遵守休藥期等，導(dǎo)致磺胺類和喹諾酮類藥物的殘留問題日趨嚴(yán)重［3］。

世界各國對SAs和QNs類藥物殘留非常重視，國際食品法典委員會(huì)（CAC）和歐美等許多國家規(guī)定，食品中SAs總量以及磺胺二甲嘧啶等單個(gè)磺胺的最大殘留限量（MRL）不得超過0.10 mg/kg［4］。目前SAs和QNs藥物的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法［5-6］、微生物法［7］、高效液相色譜-熒光法［8］、高效液相色譜法［9］、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法［10］等。酶聯(lián)免疫法和微生物法不能有效定性，高效液相法的檢出限相對較低。液質(zhì)聯(lián)用具有良好的適用性、定性定量功能及高靈敏度，已成為藥物殘留檢測的主要方法。筆者在總結(jié)文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上，建立了17種獸藥的高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，縮短了分離時(shí)間，提高了工作效率，為乳制品的快速篩查提供了準(zhǔn)確可靠的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Q-TRAP 5500型，配有H-ESI源，美國AB公司；

UFLC液相色譜系統(tǒng)：LC-20AC型，日本島津公司；

離心機(jī)：3K15型，德國Sigma公司；

渦旋儀：VORTEX GENIUS3型，德國IKA公司；

超聲清洗儀：KQ-500E型，中國昆山市超聲儀器有限公司；

電子天平：AB265-S型，瑞士梅特勒公司；

磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、氧氟沙星、磺胺甲噻二唑、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星、磺胺甲基異惡唑、磺胺多辛、磺胺二甲異惡唑、磺胺苯酰、磺胺苯吡唑、磺胺喹惡啉、磺胺硝苯標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr. Ehrenstorfer公司；

甲醇、乙 腈：色譜 純，美國Thermo Fisher Scientific公司；

甲酸：質(zhì)譜純，德國Sigma公司；

實(shí)驗(yàn)用水由Milipore純水系統(tǒng)制備。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：EndeavorsilTMC18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：0.1 %甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：2 μL；流量：0.3 mL/min；梯度洗脫：0.1～2 min B為5%，2～6 min B為5%～15%，6～11 min B為15%～20%，11～14 min B為20%～90%，14～16 min B為90%，16.1～19 min B為5。

1.2.2 質(zhì)譜條件

掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測方式：MRM多反應(yīng)監(jiān)測；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：500℃；噴霧氣壓力：345 kPa（50 Psi）；輔助加熱氣壓力：345 kPa（50 Psi）；氣簾氣壓力：207 kPa （30 Psi）；碰撞氣流速：中等。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別稱取17種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成1 000 mg/L的儲(chǔ)備液，于-20℃保存，可穩(wěn)定保存6個(gè)月。

1.4 樣品前處理

1.4.1 液體奶

準(zhǔn)確稱取5 g液體奶至離心管，加入5 mL乙腈，漩渦震蕩1 min，在4℃條件下以5 000 r/min離心5 min，將上層清液轉(zhuǎn)移至新離心管，原離心管中加入5 mL乙腈重復(fù)提取，合并提取液，取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶。

1.4.2 奶粉

準(zhǔn)確稱取1 g奶粉試樣，加入4 mL超純水溶解，后續(xù)處理步驟同液體奶。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

乳制品中含有的大量蛋白會(huì)影響液質(zhì)分析的準(zhǔn)確度，因此一般選擇乙腈沉淀蛋白法。比較了樣品與乙腈體積比為1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶3時(shí)獸藥的回收率。當(dāng)體積比大于1∶2時(shí)，獸藥平均回收率普遍大于70%。因此選擇樣品與乙腈的體積比為1∶2。

2.2 LC條件優(yōu)化

QNs的叔胺基與羧基官能團(tuán)解離會(huì)被色譜柱中殘留的硅羥基強(qiáng)烈吸附，造成峰形拖尾、色譜峰形異常及分離度降低等現(xiàn)象，所以色譜柱選擇C18柱。酸性流動(dòng)相可以降低殘留的硅羥基對目標(biāo)化合物中堿性基團(tuán)的吸附作用。SAs類藥物具有酸堿兩性，當(dāng)流動(dòng)相的pH值較高或者不添加酸時(shí)，待測組分峰形較差。當(dāng)流動(dòng)相分別添加0.1%，0.2%甲酸時(shí)，分離結(jié)果相近。過低的酸度會(huì)影響色譜系統(tǒng)的使用壽命，故選擇乙腈-0.1 %甲酸。因?yàn)闇y定獸藥數(shù)量較多，采用梯度洗脫程序進(jìn)行分離，在14 min內(nèi)完成了對17種化合物的分析，見圖1。

圖1 17種獸藥總離子流色譜圖

2.3 MS條件優(yōu)化

將1 mg/L的各標(biāo)準(zhǔn)溶液用針泵以5 μL/min的流量進(jìn)樣，在正離子模式下進(jìn)行掃描，確定母離子和子離子，以MRM模式優(yōu)化去簇電壓DP和碰撞電壓CE，使子離子在保證分辨率的條件下靈敏度最佳。以強(qiáng)度較大的子離子作為定量離子，強(qiáng)度稍小的作為定性離子，具體參數(shù)見表1。

表1 17種獸藥的質(zhì)譜條件及色譜參數(shù)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)中的提取物干擾目標(biāo)化合物的離子化，使目標(biāo)化合物在儀器檢測上的增強(qiáng)或抑制現(xiàn)象。基質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響方法的檢出限、定量限、準(zhǔn)確度和精密度等［11］?；|(zhì)效應(yīng)=［（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）-1］×100%［12］。在液體奶基質(zhì)樣品中有5種獸藥出現(xiàn)了基質(zhì)增強(qiáng)，在奶粉基質(zhì)樣品中有7種獸藥出現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)，其余均為抑制效應(yīng)。由于基質(zhì)效應(yīng)明顯，故采用基質(zhì)匹配外標(biāo)溶液對樣品中的獸藥殘留進(jìn)行定量。

2.5 工作曲線方程與檢出限和定量限

以空白基質(zhì)配制0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.00 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行測定。以被測組分的質(zhì)量濃度（X ）對色譜峰面積（Y ）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比的響應(yīng)值對應(yīng)的樣品濃度作為方法檢出限（LOD），以10倍信噪比計(jì)算定量限（LOQ）。工作曲線方程、檢出限與定量限見表2。由表2可知，17種獸藥均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.990 6～0.999 8，方法檢出限為0.05～0.10 μg/kg，定量限為0.10～0.50 μg/kg。

表2 17種獸藥線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 回收試驗(yàn)

根據(jù)歐盟獸藥殘留檢測準(zhǔn)則要求，平均回收率需在70%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）需小于20%［13］。在液體奶和奶粉中進(jìn)行回收試驗(yàn)，分別考察10.00，20.00，50.00 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下17種獸藥的回收率，結(jié)果見表3。由表3可知，方法回收率為75.88%～116.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～13%，表明方法的精密度和準(zhǔn)確度滿足檢測要求。

2.7 精密度試驗(yàn)

（1）儀器精密度。取10，100，1000 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各組分提取離子色譜峰（XIC）面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。（2）批內(nèi)精密度。取1個(gè)空白樣品平行制備6份，加入1 000.00 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在3，6，9，12 h內(nèi)進(jìn)行LC-MS分析，計(jì)算各組分提取離子色譜峰（XIC）面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。（3）批間精密度。取3個(gè)空白樣品，每個(gè)平行3份，加入1 000.00 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)測定3天，計(jì)算各組分提取離子色譜峰（XIC）面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，測定結(jié)果見表4。由表4可知，獸藥含量低的樣品其測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，說明獸藥含量對儀器精密度有影響；基質(zhì)為牛奶和奶粉時(shí)，批內(nèi)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差比批間的低，說明不同品牌的牛奶和奶粉之間存在差異。

表3 空白樣品中17種獸藥的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5） %

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6） %

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

考察濃度1 000.00 μg/kg的混合標(biāo)液在常溫條件下的穩(wěn)定性，分別在4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48 h上機(jī)，計(jì)算各組分色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～9.3%之間，混合標(biāo)液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性符合檢測要求，結(jié)果見表4。

2.9 實(shí)際樣品測定

用所建方法對本地超市的30批不同批號和品牌的乳制品進(jìn)行篩查，用已優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件和前處理方法，根據(jù)碎片離子和保留時(shí)間等信息確證。其中3個(gè)樣品檢出磺胺硝苯，含量分別為0.18，0.16，0.05 μg/kg。

3 結(jié)語

建立乳制品中獸藥的超快速液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用定量分析方法，該方法能在14 min完成17種獸藥的分析，方法檢出限為0.05～0.10 μg/kg。三重四級桿質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度和定量準(zhǔn)確性，在乳制品獸藥殘留檢測方面具有明顯優(yōu)勢。該方法具有快速、簡便、靈敏、綠色環(huán)保的特點(diǎn)，滿足日常檢測要求，適合食品檢驗(yàn)行業(yè)對磺胺和喹諾酮類抗生素的檢測。

參 考 文 獻(xiàn)

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*河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（15275505D）

聯(lián)系人：閆正；E-mail： yanzh5165323@hbu.edu.cn

中圖分類號：O657.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1008-6145（2016）01-0005-05

doi：10.3969/j.issn.1008-6145.2016.01.002

收稿日期：2015-09-08

Simultaneous Analysis of Sulfonamides and Quinolones in Milk and Milk Powder by UFLC-MS/MS

Yan Zheng1， Ren Mengwei1， Zhang Libing1， Bu Yanan1， Yang Zhaosheng1， Li Hui2
（1. College of Chemistry & Environmental Science， HeBei University， Baoding 071002， China；2. Hebei Key Laboraory of Food Safety， Hebei Food Inspecion and Research Institute， Shijiazhuang 050091， China）

AbstractSulfonamides and quinolones in milk products were determined by ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry. The proteins in milk products were precipitated by acetonitrile，then cleaned by 0.22 μm millipore filter. The filtrate was separated on a EndeavorsilTMC18column by gradient elution with acetonitrile-0.1% formic acid as mobile phase. In the range of 0.05-100.00 μg/L， mass concentration of 17 veterinary drugs was linear with peak area with correlation coefficient （r2） of 0.990 6-0.999 8. The detection limit was 0.05-0.10 μg/kg. The recoveries ranged from 75.88% to 116.00%，and the relative standard deviations were in the range of 1.5%-13%（n=5）. The method is rapid and accurate，it can meet the requirements of monitoring of antibiotics in milk products.

KeywordsUFLC-MS/MS； sulfonamides； quinolones； residue