洪建明，冼中任，曾林玉，徐　霞

(廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院　510182)

基于抗體-適配子建立的高爾基體蛋白73檢測方法的研究

洪建明，冼中任，曾林玉，徐霞

(廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院510182)

目的建立基于抗體-適配子雙夾心的高爾基體蛋白73(GP73)ELISA檢測方法，并用于血清GP73的檢測。方法以抗體-適配子雙夾心的模式，通過正交試驗和方陣滴定試驗確定GP73特異性抗體和適配子最佳工作水平、反應的溫度和時間等。以GP73 重組蛋白建立標準曲線并評價該方法靈敏度、精確度、線性及準確度等。利用該方法對59例對照組患者及77 例肝癌患者血清進行GP73水平檢測，并同步進行電化學發(fā)光定量測定甲胎蛋白(AFP)水平。結果該方法標準曲線的批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為3.87%，批間CV平均為4.44%；平均回收率為95.8%，靈敏度達12.0 ng/mL。肝癌患者血清GP73水平均明顯高于對照組、肝炎組和肝硬化組(P<0.05)。GP73對原發(fā)性肝癌診斷靈敏度為85.7%，而AFP為62.3%；而早期肝癌中GP73和AFP靈敏度分別為76.7%、36.7%。結論成功建立基于抗體-適配子夾心的GP73 ELISA 檢測方法，該方法可用于臨床檢測GP73水平。

高爾基體蛋白73;適配子;酶聯(lián)免疫吸附試驗;肝癌

高爾基體蛋白73(GP73)是相對分子質(zhì)量約為73×103的Ⅱ型跨膜糖蛋白，在健康人肝臟中表達甚微或不表達[1]；但研究發(fā)現(xiàn)其在肝癌細胞中表達明顯升高，GP73被認為是肝癌診斷的新型標志物[2]。近年來的研究更是表明,GP73診斷原發(fā)性肝癌的靈敏度可達77.0%～88.6%，明顯優(yōu)于甲胎蛋白(AFP)的40.0%～62.9%；特別是在AFP陰性原發(fā)性肝癌的診斷中GP73更具優(yōu)勢[3-5]。在以往的研究中，免疫印跡試驗和ELISA兩種方法最常用于GP73蛋白水平的檢測。其中免疫印跡試驗由于操作步驟繁多，且僅用蛋白水平半定量，無法在臨床應用推廣；ELISA中的單抗、多抗的制備時間周期長，過程復雜，純度要求高，難以控制,且抗體的修飾困難，長期保存難等限制了其臨床應用。適配子是指經(jīng)篩選后得到能與靶分子特異性結合的核酸片段，適配子能夠分辨出靶分子結構上細微的差別，甚至可以區(qū)分1個甲基或1個羥基的差別，具有高度特異性。而與抗體相比，適配子具有篩選周期短、可人工合成、方便修飾和保存、可重復利用等優(yōu)勢；迄今篩選到的凝血酶、茶堿、抗血管內(nèi)皮因子等適配子已在診斷中彰顯出廣闊的應用前景[6]。因此本研究將獲得的適配子用生物素標記作為檢測分子，并以GP73 的特異性多克隆抗體為捕獲分子，建立抗體-適配子雙夾心 ELISA 方法，并應用于臨床血清標本GP73 水平的檢測。

1資料與方法

1.1一般資料選取廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2011年3～11月的住院患者177 例為研究對象,其中肝癌患者77例，男59例，女18例，年齡23～82 歲，診斷以組織病理學為依據(jù)，腫瘤分期根據(jù)美國器官分配聯(lián)合網(wǎng)絡(UNOS)改良的TNM 分期進行，其中早期肝癌30例，包括T1期(單個腫塊小于2 cm)和T2期(單個腫塊直徑為2～5 cm；或少于3個腫塊，但每個腫塊直徑小于3 cm)；肝硬化患者21例，其中男14例，女7例，年齡35～84 歲；肝炎患者20例，其中男15例，女5例，年齡0.3～80.0歲。另選擇同期健康體檢者59 例納入對照組，排除消化道疾病及腫瘤患者，年齡24～87歲。

1.2儀器與試劑純化的GP73 重組蛋白、GP73 特異性多克隆抗體由本課題組制備；生物素標記的GP73 適配子由本課題組前期制備與驗證[7]，并交上海Invitrogen公司合成和修飾(適配子序列專列號：ZL201210235952.2)；辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素購自美國Sigma公司；酶標板購自Greiner Bio-one Cellstar公司；全自動洗板機購自Bio Rad 公司；Elx800酶標儀為美國寶特公司產(chǎn)品；E170 電化學發(fā)光儀購自羅氏公司。

1.3方法

1.3.1抗體-適配子雙夾心ELISA基本操作過程以0.05 mol/L pH9.6 Na2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋GP73 特異性多抗按試驗設定濃度包被酶標板，4 ℃過夜；用含有 0.05%(v/v)吐溫-20(Tween-20)的 PBS(PBST)洗滌3 次，拍干后加封閉液[2%牛血清清蛋白溶液(BSA)的PBST]封閉，4 ℃過夜；然后用PBST洗滌3次，按設定濃度每孔加入100 μL GP73 重組蛋白，均作復孔，酶標板在37 ℃孵育1 h后用PBST 洗滌3次，并拍干。按設計的方案在酶標孔中加入生物素標記的GP73適配子100 μL每孔，酶標板在37 ℃作用1 h 后用PBST洗滌3次，并拍干。加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素100 μL每孔，37 ℃作用1 h；PBST洗滌4次后，加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)100 μL每孔，37 ℃ 30 min；之后終止反應并在450 nm波長測定吸光度(OD)值。

1.3.2抗體-適配子雙夾心ELISA法檢測GP73 蛋白最適工作條件的確定(1)主要試劑工作濃度確立：將GP73 特異性多抗(5 mg/mL)包板設立了1∶500、1∶1 000、1∶2 000三個稀釋度，GP73 蛋白稀釋成200、100、50 ng/mL，Biotin 標志的GP73 適配子(30 μg/mL)及辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素則設立了 1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000三個工作濃度。選用四因素三水平的正交表設計各因素的交叉試驗方案，篩選確定最佳工作濃度。(2)最適封閉液的選擇：最佳工作濃度確定后，固定蛋白標準品的濃度，采用方陣試驗測試不同封閉液(pH7.4 的含1%BSA 的PBST、pH7.4 的1% 脫脂奶粉及pH7.4 的含2%BSA的PBST)與稀釋條件對結果的影響，根據(jù)標本與空白對照的差值，最終確定最適封閉液。

1.3.4精確度以標準曲線批內(nèi)誤差和批間誤差來表示該方法的精確度。(1)批內(nèi)誤差：每一標準樣品濃度做10次重復，以其批內(nèi)變異系數(shù)(CV)表示批內(nèi)誤差。(2)批間誤差：將GP73標準品各濃度平行測定10次，以其批間CV表示批間誤差。

1.3.5回收試驗于已知GP73濃度的正?；旌涎鍢吮?n=10)內(nèi)各加入系列濃度的GP73(500、400、200 ng/mL)，重復測定3次測定，計算回收率。

1.3.6血清標本GP73和AFP水平測定對59 例對照者、77 例肝癌患者、21 例肝硬化患者、20例肝炎患者進行血清GP73的測定(參照1.3.1中步驟)，同時對59 例對照組患者及77 例肝癌患者血清用E170全自動電化學發(fā)光分析儀測定AFP水平。

2結果

2.1抗體-適配子雙夾心ELISA檢測GP73最佳工作濃度的確定經(jīng)測試和對正交實驗結果比較分析后發(fā)現(xiàn)，在檢測系統(tǒng)中，采用5 μg/mL(稀釋度為1∶1 000)濃度的GP73 特異性抗體包板、生物素標記的GP73 特異性適配子工作濃度為15 ng/mL(稀釋度為1∶2 000)，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素工作濃度為1∶2 000，獲得的標本與空白對照之間的OD差值最大，見表1，因此初步確定了包板的GP73特異性抗體濃度為5 μg/mL(稀釋度為1∶1 000)、生物素標記的GP73特異性適配子工作濃度為15 ng/mL(稀釋度為1∶2 000)，辣根過氧化物酶標記的鏈親和素工作濃度為 1∶2 000。

表1　GP73 夾心ELISA 檢測系統(tǒng)的正交試驗

注：試驗組為在檢測系統(tǒng)中加有 50 ng /mLGP73 蛋白，空白組未加蛋白標準品，其他條件同試驗組。(-)表示未加鏈霉親和素，Substrate only 表示僅加有底物而未加適配體和鏈霉親和素。

2.2最佳封閉條件的確定在最適工作濃度下，采用方陣滴定試驗，分別測試3種封閉液，結果發(fā)現(xiàn)含2%BSA的PBST作封閉液能明顯減低系統(tǒng)的本底OD值而對蛋白標準品的影響不大，所產(chǎn)生的標本與空白對照之間的差值最大,見表1。因此，最終確定 GP73 雙抗體夾心ELISA檢測系統(tǒng)的最佳封閉液條件為pH7.4含2%BSA的PBST。

2.4抗體-適配子雙夾心ELISA檢測GP73方法的系統(tǒng)評價批內(nèi)CV為3.87%(2.70%～4.90%)，批間CV均值為4.44%(2.30%～6.40%)；3個濃度點的回收率均值為95.8%(92.6%～102.1%),見表3。

2.5血清標本GP73和AFP水平測定77例肝癌患者GP73水平為(178.2±89.6)ng/mL，明顯高于肝硬化患者的(68.7±18.5)ng/mL,肝炎患者的(33.8±10.3)ng/mL，以及對照組的(18.7±6.7)ng/mL(P<0.05)。肝癌患者血清AFP水平為(142.6±56.4)ng/mL，比對照組的(4.3±0.9)ng/mL，肝炎患者的(12.2±13.8)ng/mL及肝硬化患者的(16.9±22.3)ng/mL都明顯升高(P<0.05)。但早期肝癌患者血清AFP水平為(13.8±9.3)ng/mL，與其他3組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而早期肝癌組血清GP73水平為(124.3±38.9)ng/mL，比肝硬化、肝炎患者，以及對照組都明顯升高(P<0.05)。見表4。

表2　抗體-適配子雙夾心 ELISA檢測GP73方法的批內(nèi)

表3　回收率的測定

表4　各組受試者GP73、AFP表達水平

注：與肝癌組比較，*P<0.05；與早期肝癌組比較，#P<0.05。

2.6AFP與GP73的ROC曲線由ROC曲線計算GP73和AFP用于診斷肝細胞肝癌的臨界值(Cut-off值)分別為59.6、18.2 μg/L；AFP對肝細胞肝癌的診斷靈敏度明顯低于GP73(62.3%低于85.7%，P<0.05)；早期原發(fā)性肝癌GP73的靈敏度為76.7%，AFP的靈敏度僅為36.7%。GP73曲線下面積為0.884，95%置信區(qū)間為0.834～0.934。AFP曲線下面積為0.776，95%置信區(qū)間為0.706～0.845。

3討論

GP73又稱Ⅱ型高爾基體膜蛋白，少量表達于人膽管上皮細胞，在肝細胞中幾乎不表達，但在肝炎、肝硬化等疾病中GP73表達明顯上調(diào)，特別是在原發(fā)性肝癌中[8-9]。目前，眾多研究表明GP73作為新型原發(fā)性肝癌腫瘤標志物，其診斷特異度與靈敏度優(yōu)于AFP,特別是在早期原發(fā)性肝癌中[10]。Shi等[11]研究顯示原發(fā)性肝癌診斷中GP73靈敏度為68.5%，而AFP則僅為28.8%。2010年一項超過4 000例的大樣本、多中心、多種族GP73系列相關研究結果顯示，GP73診斷原發(fā)性肝癌的靈敏度及特異度分別達到了75%和97%，而AFP僅為58%和85%[12]。但Brker等[13]研究中GP73的靈敏度與特異度為60%和77%，均不及AFP的77%和96%。綜合以上研究，除了各研究入選病例不同的影響外，主要由于目前并沒有統(tǒng)一的GP73檢測方法與嚴格精確的臨界值，導致各研究間GP73靈敏度差異很大。

本試驗利用GP73特異性多抗和適配子建立了檢測GP73水平的方法，精密度與準確性均符合臨床應用要求，靈敏度可達12.5 ng/mL，檢測肝癌患者血清標本的GP73水平明顯高于其他組(P<0.05)，也驗證了本方法的實用性。此外本試驗中GP73用于原發(fā)性肝癌的診斷的靈敏度為85.7%，優(yōu)于AFP的62.3%；兩者ROC曲線下面積分別為0.884和0.776，據(jù)此推斷GP73可考慮為原發(fā)性肝癌診斷指標。而在早期肝癌組(包括T1、T2期)血清GP73平均水平明顯高于肝硬化組(P<0．05)，而血清AFP在兩組中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；早期原發(fā)性肝癌患者檢測GP73的靈敏度為76.7%，AFP靈敏度僅為36.7%；顯示了GP73在早期診斷原發(fā)性肝癌中的優(yōu)越性。此結果與Zhao等[14]研究在AFP陰性病例中GP73靈敏度達72%的結果相符。此后還需要開展肝癌患者的大樣本研究，才能進一步明確肝癌患者各分期與階段血清GP73水平的變化，以明確GP73在肝癌診斷中的應用價值。

本研究中建立了基于抗體-適配子檢測GP73的方法，具有方便、快速、靈敏度和精確度高等特點，為GP73更廣泛的應用于臨床診斷奠定了基礎；同時為適配子進一步用于臨床診斷檢測提供了依據(jù)。

[1]Kladney RD,Cui X,Bulla GA,et al.Expression of GP73,a resident Golgi membrane protein,in viral and nonviral liver disease[J].Hepatology,2002,35(6)：1431-1440.

[2]Ba MC,Long H,Tang YQ,et al.GP73 expression and its significance in the diagnosis of hepatocellular carcinoma:a review[J].Int J Clin Exp Pathol，2012，5(9):874-881.

[3]XuWJ,GuoBL,HanYG,etal.Diagnostic

value of alpha-fetoprotein-L3 and Golgi protein 73 in hepatocellular carcinomas with low AFP levels[J].Tumour Biol，2014，35(12):12069-12074.

[4]Yang J,Li J,Dai W,et al.Golgi protein 73 as a biomarker for hepatocellular carcinoma:A diagnostic meta-analysis[J].Exp Ther Med，2015，9(4):1413-1420.

[5]Morota K,Nakagawa M,Sekiya R,et al.A comparative evaluation of Golgi protein-73,fucosylated hemopexin,alphafetoprotein,and PIVKA-Ⅱ in the serum of patients with chronic hepatitis,cirrhosis,and hepatocellular carcinoma[J].Clin Chem Lab Med,2011,49(4):711-718.

[6]Mingzhe L,Hiroshi J,Hiroshi A，et.al.In vitro selection of a photoresponsive RNA aptamer to hemin[J].Bioorg Med Chem Lett，2010，20(9)：2964-2967.

[7]Du JC,Hong JM,Xu C,et al.Screening and identification of ssDNA aptamer for human GP73[J].Bio Med Res Int,2015,2015:610281.

[8]Iftikhar R,Kladney RD,Havlioglu N,et al.Disease-and cell-specific expression of GP73 in human liver disease[J].Am J Gastroenterol，2004，99(3):1087-1095.

[9]Block TM,Comunale MA,Lowman M,et al.Use of targeted glycoproteins to identify serum glycoproteins that correlated with liver cancer in woodchucks and humans[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(1):779-784.

[10]Hu JS,Wu DW,Liang S,et al.GP73,a resident Golgi glycoprotein,is sensibility and specificity for hepatocellular carcinoma of diagnosis in a hepatitis B-endemic Asian population[J].Med Oncol,2010,27(2):339-345.

[11]Shi Y,Chen J,Li L,et al.A study of diagnostic value of golgi protein GP73 and its genetic assay in primary hepatic carcinoma[J].Technol Cancer Res Treat,2011,10(3):287-294.

[12]Mao Y,Yang H,Xu H,et al.Golgi protein 73(GOLPH2)is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma[J].Gut Dec,2010,59(12):1687-1693.

[14]Zhao Y,Wang M,Cui C,et al.Significance of combined tests of serum golgi glycoprotein 73 and other biomarkers in diagnosis of small primary hepatocellular carcinoma[J].Cancer Biomark,2015,15(5):677-683.

Establishment of measuring GP73 by union of antibody and aptamer

HONGJianming,XIANZhongren,ZENGLinyu,XUXia

(KingMedCollegeofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510182,China)

ObjectiveTo establish and evaluate the method of measuring protein-GP73 by union of the specific polyclonal antibody and aptamer against GP73.MethodsBased on the model of antibody-sandwich,the optimal working concentration,reaction temperature and time were determined by orthogonal test and square titration test.The precision,linearity and accuracy of method were assessed.The levels of serum GP73 and alpha fetal protein(AFP)of 59 patients in control group and 77 patients with hepatocarcinoma were measured by antibody-aptamer ELISA and Electrochemical luminescence.ResultsThe standard curves(CV)of intra-assay and inter-assay were 3.87% and 4.44% respectively.The mean rate of callback was 95.8%，sensitive threshold was 12.0 ng/mL.The serum level of GP73 in hepatocarcinoma was significant higher than those in cirrhosis,hepatitis and control group(P<0.05).The level of GP73 in early hepatocarcinoma was significant higher than that in control group(P<0.05).The sensitivity of GP73 on diagnosis for hepatocarcinoma were 85.7%,while those of AFP were 62.3%.The sensitivity of GP73 and AFP on diagnosis for early liver cancer were 76.7% and 36.7%.ConclusionAntibody-aptamer sandwich GP73 ELISA detection method could be used for clinical detection of GP73 level.

GP73;aptamer;enzyme linked immunosorbent assay;liver cancer

2016-01-21修回日期：2016-03-23)

洪建明，男，檢驗主管技師，主要從事免疫檢驗研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.013

A

1673-4130(2016)12-1627-04

·論著·