鐘新仙，林有鋮，曾建強，彭　艷，黃玉鳳，趙海源，馮崎鵬，李慶余

(廣西師范大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004)

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藥物載體碳納米管的制備及其抗腫瘤活性*

鐘新仙，林有鋮，曾建強，彭艷，黃玉鳳，趙海源，馮崎鵬，李慶余

(廣西師范大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004)

摘要：以碳納米管為基底，在混酸中氧化碳納米管，進一步接枝L-色氨酸(Trp)、磷酸(P)，制備水溶性良好的L-色氨酸改性碳納米管(Trp-ox-CNTs)和磷酸、L-色氨酸共改性碳納米管(Trp-P-ox-CNTs)；再分別與厚樸酚(M)、和厚樸酚(HK)復(fù)合，制備改性碳納米管載藥材料。采用掃描電子顯微鏡(SEM)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、X射線衍射儀(XRD)對其形貌和結(jié)構(gòu)進行表征；快速循環(huán)伏安法(CV)對復(fù)合材料進行測試，用MTT法考察載藥材料體外抗腫瘤活性和細胞毒性情況。結(jié)果表明，改性碳納米管都具有良好的水溶性；CNTs共價鍵合磷酸、L-色氨酸后，對正常細胞的毒性明顯降低，生物相容性顯著提高，復(fù)合藥物載體材料表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性。

關(guān)鍵詞：碳納米管；磷酸；色氨酸；藥物載體

0引言

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料，特別是用于傳統(tǒng)藥物體內(nèi)運輸且可以提高藥物的靶向性、利用率、降低藥物毒副作用的納米粒子，是現(xiàn)代醫(yī)藥發(fā)展的突破點[1-3]。碳納米管(carbonnanotubes,CNTs)因具有較大的比表面積、可容納生物特異性分子和空腔結(jié)構(gòu)藥物以及優(yōu)良的細胞穿透性等性能，成為藥物載體研究的熱點[4-5]。然而，CNTs水溶性差，在體內(nèi)外具有一定的毒性，這限制了它在藥物載體領(lǐng)域的應(yīng)用[6-7]。而功能化后的CNTs生理溶解性、生物相容性都得到提高，這為其在藥物載體領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前，對CNTs改性修飾主要有共價修飾和非共價修飾兩類[8]，非共價修飾主要是通過分子間π-π堆積和范德華作用力等提高CNTs的分散性能，進而阻止其聚集。共價修飾則是利用CNTs表面缺陷，通過氧化、環(huán)加成、酰胺化等反應(yīng)在其表面通過化學(xué)鍵的作用連接功能基團，與非共價修飾相比，通過共價修飾的CNTs，具有更好的穩(wěn)定性和生物相容性[9-10]。有關(guān)文獻報道[11-12]，混合濃酸可將CNTs切成短管，在開口頂端生成羥基、羧基、羰基等活性基團，增強CNTs的水溶性。此外，羧基化的CNTs經(jīng)二氯亞砜處理后得到具有較高活性的酰氯基團，再進一步與氨基化合物反應(yīng)，可得生物相容性良好的改性CNTs[13-15]。本文擬采用共價改性方法制備藥物載體CNTs，先用混酸氧化處理多壁碳納米管，進一步接枝L-色氨酸、磷酸，再與具有抗腫瘤作用的厚樸酚與和厚樸酚進行復(fù)合，分析比較改性前后CNTs的水溶性、生物相容性和抗腫瘤活性。

1實驗

1.1實驗試劑

多壁碳納米管，MWCNTs，廣東深圳市納米管有限公司；厚樸酚、和厚樸酚，上海純優(yōu)生物科技有限公司，分析純；N,N′-二環(huán)己基碳亞二胺(DCC)、二氯亞砜(SOCl2)、鐵氰化鉀、L-色氨酸，阿拉丁試劑有限公司，分析純；硝酸、硫酸、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，西隴化工股份有限公司，分析純；宮頸癌細胞(Hela)、肝癌細胞(HepG2)、人肝臟細胞(7702)，實驗室培養(yǎng)。

1.2材料的制備

1.2.1改性碳納米管的制備

先用濃HNO3和濃H2SO4對MWNTs進行氧化處理，制得氧化碳納米管(ox-CNTs)。取0.1gox-CNTs于圓底燒瓶中，加入15mLSOCl2和1mLDMF，80 ℃回流24h，除去未反應(yīng)的SOCl2，得酰氯化的碳納米管；繼續(xù)加入0.2gL-色氨酸，10mLDMF，100 ℃恒溫回流24h；冷卻、洗滌、離心，60 ℃下真空干燥24h，得到Trp-ox-CNTs。相同的條件，制備酰氯化的碳納米管后，再加5mL磷酸和10mLDMF，100 ℃下回流24h，冷卻，DMF多次洗滌，離心得到磷酸修飾的碳納米管(P-ox-CNTs)；繼續(xù)加入0.2gL-色氨酸，10mLDMF，100 ℃恒溫回流24h；冷卻、洗滌、離心，60 ℃下真空干燥24h，得到Trp-P-ox-CNTs。

1.2.2改性碳納米管載藥物的制備

往兩支小試管各加入0.05gTrp-ox-CNTs、1mL甲苯、一定量DCC，分別加入0.5mg厚樸酚與0.5mg和厚樸酚，攪拌24h，洗滌、離心，真空干燥，得到色氨酸修飾碳納米管負載厚樸酚物質(zhì)(M-Trp-ox-CNTs)和色氨酸修飾碳納米管負載和厚樸酚的物質(zhì)(HK-Trp-ox-CNTs)；同樣方法，平行制得M-ox-CNTs、M-Trp-P-ox-CNTs、HK-ox-CNTs、HK-Trp-P-ox-CNTs，合成路線見圖1。

圖1　藥物載體的合成路線

1.3測試與表征

為了確定MWCNTs的改性效果及其與磷酸、色氨酸的結(jié)合方式，應(yīng)用FT-IR進行紅外光譜測試分析，美國PerkinElmer公司PESpectrumOne；采用XRD(日本理學(xué)公司的RigakuD/max2500v/pc型)表征CNTs改性前后的結(jié)構(gòu)和晶型；采用SEM對樣品的表面形貌進行表征分析，荷蘭飛利浦公司FEIQuanta200FEG；使用LK98Ⅱ微機電化學(xué)分析系統(tǒng)工作站，天津蘭力科化學(xué)電子高科技有限公司和三電極體系(飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，石墨電極作為工作電極)進行電化學(xué)測試分析。

1.4細胞實驗

為了考察改性碳納米管載藥效果，采用MTT法測定復(fù)合藥物載體對Hela細胞株、HepG2細胞株和7702細胞株的抑制率。取0.6mg樣品溶解在1mL蒸餾水中備用。分別接種一定數(shù)量的Hela、HepG2、7702細胞株于96孔板培養(yǎng)板中，24h后依次加入20μL復(fù)合藥物水溶液，藥物作用24h后，用酶標儀在波長570nm下測定，記錄每孔的光密度(OD)值，計算細胞抑制率(IR)[16]

(1)

2結(jié)果與討論

2.1改性碳納米管水溶性比較

為了研究改性CNTs水溶性，分別將等量CNTs、ox-CNTs、Trp-ox-CNTs和Trp-P-ox-CNTs溶解在10 mL蒸餾水中，超聲分散2 min后靜置。圖2為超聲后靜置0，30 min，10 d后的水溶性比較圖。結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的CNTs有明顯沉降現(xiàn)象，水溶性最差；ox-CNTs均勻分散在水中，這是由于CNTs經(jīng)酸氧化處理，引入了羧基、羥基等親水基團，提高了其水溶性；靜置10 d后Trp-ox-CNTs出現(xiàn)模糊的分層現(xiàn)象，由于色氨酸上雜環(huán)等疏水結(jié)構(gòu)降低了Trp-ox-CNTs在水中的分散性；Trp-P-ox-CNTs表面接枝磷酸基團后，水溶性更好，穩(wěn)定存在時間更長。水溶性的不同，初步表明目標基團已修飾到CNTs上。

圖2　CNTs、ox-CNTs、Trp-ox-CNTs和Trp-P-ox-CNTs的水溶性比較

2.2紅外光譜分析

圖3ox-CNTs、Trp-ox-CNTs和Trp-P-ox-CNTs的FT-IR圖

Fig 3 FT-IR spectra of ox-CNTs, Trp-ox-CNTs and Trp-P-ox-CNTs

2.3X射線衍射分析

圖4為CNTs(曲線(a))、ox-CNTs(曲線(b))、Trp-ox-CNTs(曲線(c))和Trp-P-ox-CNTs(曲線(d))的XRD圖。從圖4可知，4條曲線均在相同位置出現(xiàn)2個衍射峰，即CNTs的2個特征峰，約25. 8°處的(002)衍射峰和約44°處的(100)衍射峰。改性前后碳納米管的特征X射線衍射峰沒有明顯變化，說明CNTs經(jīng)化學(xué)處理后，其晶型無明顯變化[17-18]。

圖4CNTs、ox-CNTs、Trp-ox-CNTs和Trp-P-ox-CNTs的XRD圖

Fig 4 X-ray diffraction pattern of CNTs, ox-CNTs, Trp-ox-CNTs and Trp-P-ox-CNTs

2.4場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡表征與分析

圖5為材料的SEM圖。圖5(a)的CNTs較長、彎曲程度大、結(jié)構(gòu)完整。圖5(b)和(c)相比圖5(a)表面顯得更為平整，由于CNTs經(jīng)混酸處理、酰氯化和氨化改性后，CNTs長度變短，端帽打開，表面引入缺陷，反應(yīng)活性增強，形成酰胺鍵等基團[18]。圖5(d)-(i)為改性碳納米管負載厚樸酚或和厚樸酚后的SEM圖，對比可看出，載藥后碳納米管的支鏈增長、管徑變大、分散程度增強。

2.5循環(huán)伏安法測試與分析

采用CV技術(shù)，以復(fù)合藥物載體/石墨電極為工作電極，在0.01 mol/L的鐵氰化鉀溶液中，進行電化學(xué)性能測試。研究結(jié)果如圖6，除了HK-ox-CNTs(圖6(d))不是很明顯外，其余復(fù)合藥物載體/石墨電極基本都出現(xiàn)兩個明顯的氧化峰和一個還原峰，峰形不對稱，表明其電化學(xué)氧化為不可逆過程[19-21]，初步斷定厚樸酚與和厚樸酚已負載到改性碳納米管上。

圖5　掃描電鏡圖

圖6　在鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安圖

2.6細胞實驗分析

采用MTT法分析復(fù)合藥物載體的抗腫瘤活性和對正常細胞的毒性。實驗數(shù)據(jù)顯示，改性碳納米管ox-CNTs、Trp-ox-CNTs、Trp-P-ox-CNTs對這3種細胞株都有一定的抑制率，由于改性后CNTs的表面活性點與細胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生作用，促進細胞凋亡。其中，復(fù)合藥物載體材料對腫瘤細胞的抑制率都比對應(yīng)的改性碳納米管要高，表明厚樸酚/和厚樸酚負載到改性碳納米管上，對腫瘤細胞產(chǎn)生較高的抑制作用，但其對抑制率的提升不大?？赡茉颍?1) 復(fù)合藥物載體在制備時改性碳納米管與藥物的反應(yīng)質(zhì)量比為100∶1，藥物負載到改性碳納米管上的量相對較?。?2) 復(fù)合藥物載體在水中不能完全溶解，即實際濃度小于理論濃度。圖7(C)為復(fù)合藥物載體材料對人體正常細胞毒性分析的數(shù)據(jù)圖，ox-CNTs、Trp-ox-CNTs、Trp-P-ox-CNTs對7702細胞株的抑制率分別為37.74%，4.03%，14.05%，共價修飾后的CNTs對7702細胞株的抑制率比單純氧化改性的CNTs要低得多。此外，單純氧化改性碳納米管載藥物的復(fù)合材料對7702細胞株的毒性也都大于共價修飾碳納米管載藥物的復(fù)合材料，說明CNTs經(jīng)共價改性后的細胞毒性及生物相容性都得到改善。

圖7　復(fù)合藥物載體對Hela細胞株、HepG2細胞株、7702細胞株的抑制率

3結(jié)論

采用共價修飾的方法可簡便地將氨基酸、磷酸等修飾到CNTs表面，得到Trp-ox-CNTs、Trp-P-ox-CNTs功能化CNTs載體。水溶性實驗、細胞毒性測定表明共價改性后的CNTs水溶性、生物相容性明顯改善，Trp-P-ox-CNTs水溶性相對較好。改性碳納米管復(fù)合藥物材料M-ox-CNTs、M-Trp-ox-CNTs、M-Trp-P-ox-CNTs、HK-ox-CNTs、HK-Trp-ox-CNTs、HK-Trp-P-ox-CNTs對腫瘤細胞都具有良好的抑制率。改性碳納米管載藥復(fù)合材料的細胞毒性遠小于單純氧化改性碳納米管載藥材料，表明共價改性后CNTs細胞毒性明顯降低。

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Preparation and antineoplastic activity of functionalized carbon nanotubes as drug carriers

ZHONG Xinxian，LIN Youcheng，ZENG Jianqiang，PENG Yan，HUANG Yufeng，ZHAO Haiyuan，F(xiàn)ENG Qipeng，LI Qingyu

(Key Laboratory for the Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources,Ministry of Education of China, School of Chemistry and Pharmaceutical Sciences,Guangxi Normal University, Guilin 541004, China)

Abstract:In this paper, carbon nanotubes (CNTs) as substrates were oxidatized by mixed acid, and were further grafted by tryptophan (Trp) and phosphate (P) for preparing modified carbon nanotubes materials with better water solubility (Trp-P-ox-CNTs and Trp-ox-CNTs). Then the modified carbon nanotubes were recombined with honokiol (HK) and magnolol (M), respectively. These drug carriers based on carbon nanotubes were obtained. The morphology and microstructure of the modified carbon nanotubes were characterized by scanning electron microscopy (SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and X-ray diffraction (XRD). These drug carriers were characterized by cyclic voltammetry (CV) and their in vitro antitumor activity and cell toxicity were analysed by MTT assay. These results showed that the functionalized carbon nanotubes have good solubility in water. After covalent bonding with phosphate, tryptophan the toxicity of CNTs to normal cells is,reduced significantly, their biocompatibility is observably improved,and these combination drug carrier materials exhibit good anti-tumor activity.

Key words:carbon nanotubes; phosphoric acid; tryptophan; drug carrier

文章編號：1001-9731(2016)06-06194-06

* 基金項目：國家杰出青年科學(xué)基金資助項目(51064004)；中國博士后科學(xué)基金資助項目(2014M562499XB)；校重點實驗室自主研究課題資助項目(CMEMR2012-A06)

作者簡介：鐘新仙(1973-)，女，廣西桂林人，教授，博士，主要從事應(yīng)用電化學(xué)研究。

中圖分類號：TB383.1

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.06.036

收到初稿日期：2015-06-16 收到修改稿日期：2015-11-25 通訊作者：鐘新仙，E-mail:zhongxx2004@163.com