崔月龍王 博姬穎華路 平*（ 濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院放療科，河南 濮陽 455000； 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 新鄉(xiāng) 453000）

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EGFR核內(nèi)遷移與食管癌順鉑耐藥的相關(guān)性研究

崔月龍1王 博2姬穎華2路 平2*
（1 濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院放療科，河南 濮陽 455000；2 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 新鄉(xiāng) 453000）

【摘要】目的 分析表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在食管鱗癌中的表達，并探討其細胞核內(nèi)遷移與食管癌順鉑耐藥之間的相關(guān)性。方法 ①用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術(shù)檢測10例順鉑化療敏感者食管癌組織標本（敏感組）、10例順鉑化療耐藥食管癌組織標本（耐藥組）EGFR表達情況及其與順鉑化療耐藥的關(guān)系；②用免疫組化法檢測食管癌標本及其細胞株EGFR的表達情況；③用順鉑干預食管癌EC9706細胞，并用熒光顯微鏡觀察細胞核內(nèi)EGFR的表達情況；結(jié)果 ①順鉑耐藥組食管癌組織中EGFR的表達率顯著高于順鉑化療敏感組（P＜0.05）。②EC-9706細胞膜上EGFR高表達。③順鉑干預后EC9706細胞核內(nèi)EGFR表達增高。結(jié)論 EGFR核內(nèi)遷移與食管癌順鉑化療耐藥可能有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】食管癌；表皮生長因子受體核內(nèi)遷移；順鉑耐藥；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應

中國是世界上食管癌發(fā)病率及病死率最高的國家之一，全球每年新增30萬食管癌患者中，約有一半發(fā)生在中國［1］，且多數(shù)食管癌確診時已經(jīng)屬于中晚期［2］，錯過手術(shù)治療的時機，因此化療就成為中晚期食管癌主要的治療手段之一。順鉑是食管癌化療一線用藥，但耐藥嚴重影響其療效。新近研究表明核內(nèi)EGFR與化療療效相關(guān)，可能影響耐藥。有一項鼠實驗結(jié)果已經(jīng)證明順鉑可以促使EGFR向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，并且順鉑引起的DNA損傷可以通過EGFR核內(nèi)轉(zhuǎn)移得到修復［3］。因此，本實驗通過檢測EGFR在食管癌耐藥組及敏感組的表達及觀察順鉑干預食管癌EC9706細胞核內(nèi)EGFR的表達情況，探討EGFR核內(nèi)遷移與食管癌順鉑耐藥的關(guān)系。進而為逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥和尋找新的基因靶點提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源：選取2010年6月至2012年10月新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院收治的Ⅱ～Ⅲ期食管癌病例共20例。入選標準：①在我院初治，病理確診為鱗狀上皮細胞癌。②取腫瘤組織標準前沒有接受過放療。③術(shù)后均接受單藥順鉑化療。④有詳細的臨床病理資料。

1.2 試劑：食管癌細胞EC-9706、EC-1細胞（新鄉(xiāng)醫(yī)學院神經(jīng)病學實驗室提供），EGFR兔單抗（Cell Tignaling Technology），山羊抗兔（Cell Tignaling Technology），順鉑（江蘇豪森），Trizol試劑（Invitrogen）；AMV Reverse Transcriptase （Themo Scientific）；RT-PCR試劑盒購于天跟公司；PCR引物購于生工生物（上海）股份有限公司；無水乙醇、氯丙醇、氯仿 國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 熒光實時定量PCR檢測兩組中EGFR的表達：Trizol法提取兩組中食管癌組織的總RNA。用紫外分光光度儀檢測RNA濃度和純度，其A260/280比值在1.8～2.0。取上述RNA 1 μg（按RNA濃度的換算取用），采用AMV Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設計相應的PCR引物序列，采用SYBR green作為熒光染料，以U6snRNA為內(nèi)參進行標準化，應用Bio-Rad CFX96定量PCR儀進行熒光實時定量PCR。反應體系為總體積20 μL，其中cDNA 模板2 μL、dNTP Mixture0.8 μL、上游引物，10 mmol/L 0.5 μL、下游引物，10 mmol/L 0.5μL、cDNA模板2 μL、Taq 酶0.2 μL、RNase Free dH2O15 μL。PCR循環(huán)條件為：第一步：94 ℃預變性1 min，第二步：94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 1 min共40個循環(huán)，溶解曲線分析穩(wěn)定為（70～95 ℃）。為保證實驗的可靠性，所有標本均至少重復一次PCR反應。

1.3.2 免疫組化法選擇EGFR高表達食管癌細胞EC-9706。分別取對數(shù)生長期EC-9706細胞、EC-1細胞，胰酶消化后計數(shù)，在載玻片上劃定區(qū)域，細胞懸液種于載玻片上，載玻片四周滴0.01 mol/LPBS溶液防止培養(yǎng)基揮發(fā)。24 h后待細胞貼壁，洗去多余的培養(yǎng)基，PBS沖洗后用4%多聚甲醛固定40 min，3%的H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗稀釋液，于4 ℃冰箱過夜，加二抗，DAB顯色。顯微鏡觀察兩組細胞細胞膜EGFR表達情況。

1.3.3 用順鉑干預食管EC-9706細胞，觀察用藥前后細胞核內(nèi)EGFR的表達情況。取對數(shù)生長期EC-9706細胞，胰酶消化后計數(shù)，重懸細胞于完全培養(yǎng)基中（6孔板），細胞爬片，2孔一組，分為空白組和對照組；對照組細胞生長48 h后加入順鉑（濃度為50 μmol/L）作用12 h；兩組均0.01 mol/PBS溶液洗滌5 min×3次，4%多聚甲醛固定40 min，0.01 mol/PBS溶液洗滌5 min×3次，加入0.1%TritonX-100通透10 min，0.01 mol/PBS溶液洗滌5 min×3次，10%山羊血清封閉30 min，勿洗，加入一抗（EGFR兔單抗1∶70）4 ℃潮濕環(huán)境下避光18 h，0.01 mol/PBS溶液洗滌5 min×3次加入熒光素標記二抗（山羊抗兔）室溫作用2 h（避光），0.01 mol/PBS溶液洗滌5 min×3次加入50%甘油封片；熒光顯微鏡下觀察細胞，空白組、對照組細胞核內(nèi)的EGFR表達情況。

1.4 統(tǒng)計學分析：應用SPSSl6.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差（±s）表示，在檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)分布及方差齊性的條件下，采用方差分析進行兩組間數(shù)據(jù)比較，P值＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組標本中EGFR表達：耐藥組中EGFR的表達明顯高于敏感組。差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

2.2 免疫組化法選擇EGFR高表達食管癌細胞EC-9706，實驗結(jié)果顯示EGFR在EC-9706細胞膜上高表達。見圖2、3。

2.3 順鉑干預后核內(nèi)EGFR的表達情況：順鉑干預后，核內(nèi)EGFR的表達明顯高于干預前，提示順鉑化療能誘導食管癌細胞EGFR核內(nèi)遷移。見圖4、5。

表1 RT-PCR檢測兩組中EGFR表達的水平（±s）

表1 RT-PCR檢測兩組中EGFR表達的水平（±s）

注：t=-4.12，P=0.001，P＜0.01

組別　EGFR的相對表達量（相對內(nèi)參）敏感組　4.31±0.95耐藥組　0.36±0.22

圖1 敏感組與耐藥組中EGFR的相對表達量比較　

圖2 EC-9706

圖3 EC-1

圖4 空白組核內(nèi)EGFR未見明顯表達

圖5 對照組核內(nèi)EGFR較空白組明顯增多

3 討 論

食管癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤，治療以手術(shù)為主輔以放化療綜合治療，但復發(fā)率高，臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥是導致食管癌綜合治療失敗的關(guān)鍵因素。食管癌的發(fā)生就是一個多基因變異累計的過程［4］，耐藥產(chǎn)生的機制非常復雜，是多基因、多步驟作用的結(jié)果。其中DNA修復機制在順鉑耐藥中起重要作用，ERCC1是DNA修復的主要基因，但其與順鉑耐藥性不成直線關(guān)系［5］。表皮生長因子受體（EGFR）是一種據(jù)有酪氨酸激酶活性糖蛋白，相對分子質(zhì)量170 kDa，位于染色體7q12，在人類惡性腫瘤中普遍過度表達。EGFR為跨膜受體，由胞外的配體結(jié)合區(qū)域和細胞內(nèi)的酪氨酸激酶活性區(qū)域組成。EGFR的胞外結(jié)合區(qū)與相應的配體結(jié)合，通過RAS/RAF/MEK、PI3K/AKT、PLCγ/PKC、SRC激酶和STAT等信號通路，從而調(diào)控細胞核內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性發(fā)揮相應的生物學，包括細胞的增殖、存活、凋亡、侵襲等方面［6］。研究表明除了這些傳統(tǒng)的胞質(zhì)信號傳導通路外，EGFR在原發(fā)腫瘤細胞中和其他的一些高增值組織的細胞核內(nèi)被持續(xù)監(jiān)測到［7］。臨床研究顯示，肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、膠質(zhì)瘤以及頭頸部惡性腫瘤等腫瘤都有一定程度EGFR高表達，并與患者的病情進展、放化療敏感性以及預后相關(guān)［8］。本研究首先從基因水平上分析EGFR在敏感組及耐藥組的核內(nèi)表達情況，結(jié)果表明：EGFR在耐藥組的核內(nèi)表達明顯高于敏感組（P＜0.05）。其次用免疫組化方法觀察EGFR在食管癌細胞EC9706 和EC1細胞的表達情況，顯示EGFR在食管癌細胞EC-9706細胞膜呈高表達。再次在細胞學水平上用熒光顯微鏡觀察順鉑干預食管EC-9706細胞核內(nèi)EGFR的表達情況，顯示順鉑化療能誘導食管癌細胞EGFR核內(nèi)遷移，即上述結(jié)果表明EGFR在食管癌組織中有恒定的表達，并且核內(nèi)表達水平與食管癌順鉑化療耐藥有關(guān)，這可能是EGFR核內(nèi)易位促進化療損傷后DNA的修復有關(guān)。EGFR表達陽性的腫瘤具有更強的轉(zhuǎn)移力和侵襲性，對放療化療不敏感，復發(fā)率高，生存期短。Park SJ等研究結(jié)果顯示：腫瘤細胞過度表達EGFR時顯示耐藥性增加［9］，與本研究結(jié)果較一致?？傊?，EGFR核內(nèi)轉(zhuǎn)移與順鉑化療耐藥有關(guān)。這對于闡明順鉑耐藥機制，提供逆轉(zhuǎn)耐藥靶點、提高食管癌的化療療效及改善預后意義重大。

參考文獻

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中圖分類號：R735.1

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）10-0126-02

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