張亞琴

(河南省鄭州市中心醫(yī)院大內(nèi)科　450000)

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miR-21對氧化應激誘導的心肌細胞損傷的影響

張亞琴

(河南省鄭州市中心醫(yī)院大內(nèi)科450000)

[摘要]目的探討miR-21對過氧化氫(H2O2)誘導的H9c2心肌細胞損傷的影響。方法體外培養(yǎng)H9c2心肌細胞，實驗分為4組，空白對照組、陰性對照組(miR-21 mimics NC)、H2O2組、H2O2+miR-21 mimics組；采用MTT法及AnnexinV-PI流式雙染法檢測各組細胞活力和凋亡情況；DCFH-DA探針負載方法檢測各組細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平；分光光度法檢測各組丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)水平；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測程序性細胞死亡因子4(PDCD4)、Bax、Bcl-2及人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因蛋白(PTEN)/蛋白激酶(AKT)信號通路激活情況。結果與空白對照組及陰性對照組比較，H2O2組中細胞活力下降(P<0.01)，ROS熒光強度及MDA水平增加(P<0.01)，SOD水平下降(P<0.01)，細胞凋亡率上升(P<0.01)，Bcl-2表達及AKT磷酸水平下調(P<0.01)，Bax、PDCD4及PTEN表達上調(P<0.01)。與H2O2組比較，H2O2+miR-21 mimics組中細胞活力提高(P<0.01)，ROS熒光強度及MDA水平降低(P<0.01)，SOD水平提高(P<0.01)，細胞凋亡率降低(P<0.01)，Bcl-2表達及AKT磷酸水平上調(P<0.01)，Bax、PDCD4及PTEN表達下調(P<0.01)。結論miR-21過表達能顯著抑制H9c2心肌細胞氧化應激損傷，與清除細胞內(nèi)氧化應激產(chǎn)物及抵抗細胞凋亡有關，可能是通過PTEN/AKT信號通路實現(xiàn)的。

[關鍵詞]miR-21；H9c2心肌細胞；氧化應激；凋亡

心肌細胞氧化應激及其導致的凋亡是心肌梗死、心力衰竭、高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病的重要機制，通過阻斷心肌細胞氧化應激損傷，從而減輕心肌細胞凋亡對于心血管疾病的治療具有一定的應用價值[1]。以往對miRNA的關注主要集中于腫瘤形成中，近些年來miRNA在心血管疾病中的作用逐漸進入公眾視野，已有數(shù)十種miRNA在心肌細胞中特異性表達，如miR-1、miR-29、miR-21、miR-126、miR-133、miR-199、miR-24等，并參與了心力衰竭、心律失常、心臟肥大、心臟缺血/再灌注等病理過程[2-3]。miR-21不僅在眾多組織器官包括心臟、小腸、腦、乳腺及胰腺上表達，在心肌細胞，血管平滑肌細胞，血管內(nèi)皮細胞，等心血管細胞類型中皆有表達，并在心肌梗死、心力衰竭、心臟肥大等過程中差異性表達[4-5]。已證實過氧化氫(H2O2)刺激乳鼠心肌細胞后導致miR-21表達量上調，且miR-21類似物能抑制H2O2誘導的乳鼠心肌細胞凋亡[6]，但具體機制未知。因此，本研究在此基礎上，通過H2O2刺激H9c2心肌細胞產(chǎn)生氧化應激及細胞凋亡，并加入miR-21類似物進行干預，從而探討miR-21對H9c2心肌細胞氧化應激及細胞凋亡的影響及具體機制。

1材料與方法

1.1材料大鼠心肌細胞H9c2購于中國科學院上海細胞庫(目錄號：GNR5)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。DCFH-DA探針購自碧云天生物技術研究所；超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Gibco公司。miR-21 mimics及miR-21 mimics NC由廣州市銳博生物科技有限公司訂購合成。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉印電泳儀購自北京六一儀器廠；FACSCanto流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染及分組采用適量無血清Opti-MEM?Ⅰ培養(yǎng)基分別稀釋稀釋miRNAs及 Lipofectamine 2000。將稀釋的Lipofectamine 2000和稀釋的miRNAs混合，室溫孵育20～30 min；將miRNAs/Lipofectamine 2000復合物加入96或6孔板，6 h后換成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h，熒光顯微鏡下檢測轉染效率并RT-PCR法驗證轉染情況。miR-21 mimics及miR-21 NC轉染濃度分別為200 nm和200 nm。將實驗分為4組，空白對照組，陰性對照組(miR-21 mimics NC)，H2O2組，H2O2+miR-21 mimics組。

1.2.2RT-PCR檢測OA軟骨細胞中Sirt1的表達按1.2.1進行操作后，參考Trizol試劑盒 (Invitrogen) 使用說明書提取總RNA。引物如下，miR-21上游引物：5′-GCC GCT AGC TTA TCA GAC TGA TGT-3′，下游引物：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；GAPDH上游引物：5′-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3′，下游引物：5′-TCT CCT GGG AGG CAT AGA CC-3′。通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA并進行PCR擴增，獲取5 μL擴增產(chǎn)物用于下一步2%的瓊脂糖膠進行檢測并拍照。

1.2.3細胞活力檢測采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法按1.2.1分組方法進行給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，4 h后，棄上清液，并每孔加入DMSO 150 μL，10 min后，酶標儀570 nm處測定吸光度(A)值。

1.2.4細胞內(nèi)ROS水平測定按照1.2.1處理細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，后加入含有20 μmol/L DCFH-DA 的PBS，37 ℃孵育2 h，后熒光顯微鏡下進行檢測。熒光強度與細胞內(nèi)ROS水平呈正相關，由此可反映細胞內(nèi)ROS水平。

1.2.5細胞內(nèi)MDA、SOD水平按照1.2.1處理細胞后，培養(yǎng)48 h，后離心收集細胞，反復凍融，使細胞內(nèi)容物流出，取上清液檢測MDA及SOD水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.6Annexin V-PI流式雙染按照1.2.1處理細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，避光染色30 min上機檢測。按照Annexin V-FITC/ PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，用0.25%的胰蛋白酶消化，PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min，收集細胞；按順序分別加入500 μL Binding Buffer，5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI 5，混勻，于室溫避光反應10 min，在1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.2.7蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測按照1.2.1處理細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞樣本，加入裂解液裂解，離心，獲得蛋白樣品。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白上樣，進行十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜。次日加二抗孵育后曝光。用Quantity one軟件對蛋白灰度值進行分析。

2結果

2.1各組細胞中miR-21 mimics轉染及miR-21表達情況經(jīng)熒光顯微鏡觀察拍照，并計算熒光強度，發(fā)現(xiàn)轉染效率高達80%以上，說明轉染成功。經(jīng)miR-21 mimic轉染后，細胞中miR-21表達量上調，見圖1。

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：H2O2組；D：H2O2+miR-21 mimics組；a：P<0.01，與空白對照組及陰性對照組比較；b：P<0.01，與H2O2組比較。

圖1各組細胞中miR-21表達情況

2.2各組細胞活力的測定與空白對照組(92.79±3.85)%及陰性對照組(90.03±1.24)%比較，H2O2組細胞活力(48.21±2.66)%顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與H2O2組比較，H2O2+miR-21 mimics組中細胞活力(80.77±4.32)%顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：H2O2組；D：H2O2+miR-21 mimics組；a：P<0.01，與空白對照組及陰性對照組比較；b：P<0.01，與H2O2組比較。

圖2各組細胞活力的測定

2.3各組細胞中ROS熒光強度的測定與空白對照組及陰性對照組比較，H2O2組中ROS熒光強度上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與H2O2組比較，H2O2+miR-21 mimics組中ROS中熒光強度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

2.4各組細胞中MDA和SOD水平的測定與空白對照組及陰性對照組比較，H2O2組中MDA水平上升，SOD水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與H2O2組比較，H2O2+miR-21 mimics組中MDA水平降低，SOD水平上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

2.5各組細胞凋亡的測定與空白對照組及陰性對照組比較，H2O2組中心肌細胞凋亡率顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與H2O2組比較，H2O2+miR-21 mimics組中細胞凋亡率下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：H2O2組；D：H2O2+miR-21 mimics組；a：P<0.01，與空白對照組及陰性對照組比較；b：P<0.01，與H2O2組比較。

圖3　各組細胞中ROS熒光強度的測定

a：P<0.01，與空白對照組及陰性對照組比較；b：P<0.01，與H2O2組比較。

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：H2O2組；D：H2O2+miR-21 mimics組。

圖4各組細胞凋亡的測定

2.6各組細胞中凋亡相關蛋白的測定與空白對照組及陰性對照組比較，H2O2組中Bcl-2表達下調，Bax及PDCD4表達上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與H2O2組比較，H2O2+miR-21 mimics組中Bcl-2表達上調，Bax及PDCD4表達下調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2，圖5。

2.7各組細胞中PTEN/AKT激活情況與空白對照組及陰性對照組比較，H2O2組中PTEN表達上調，AKT磷酸化水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與H2O2組比較，H2O2+miR-21 mimics組中PTEN表達下調，AKT磷酸化水平提高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3，圖6。

圖5　各組細胞中凋亡相關蛋白的測定

組別Bax/GADPHBcl-2/GADPHPDCD4/GADPH空白對照組0.124±0.0231.005±0.0740.432±0.037陰性對照組0.129±0.0251.002±0.0980.433±0.042H2O2組1.035±0.096a0.100±0.009a1.205±0.114aH2O2+miR-21mimics組0.120±0.011b0.935±0.094b0.458±0.046b

a：P<0.01，與空白對照組及陰性對照組比較；b：P<0.01，與H2O2組比較。

圖6　各組細胞中PTEN/AKT激活情況

組別PTEN/GADPHp-AKT/AKT空白對照組0.198±0.0141.215±0.100陰性對照組0.189±0.0131.212±0.894H2O2組0.521±0.043a0.463±0.042aH2O2+miR-21mimics組0.223±0.020b0.998±0.096b

a：P<0.01，與空白對照組及陰性對照組比較；b：P<0.01，與H2O2組比較。

3討論

miR-21是2001年有學者在非脊椎動物和脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的，隨后在小鼠的神經(jīng)元細胞及Hela細胞中陸續(xù)檢測到，miR-21基因定位于17號染色體，全長22 nt，是一種高度保守的內(nèi)源性小分子RNA，它能夠結合于靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)域，阻遏靶基因的翻譯，從而抑制靶基因表達，并在多種人類腫瘤細胞中呈過表達[7]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，miR-21參與心肌梗死、心力衰竭、心律不齊、心臟肥大等心血管疾病的生理病理過程[4-5]。Cheng等[6]發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激乳鼠心肌細胞會導致miR-21的表達上調，而miR-21類似物的轉染能減輕H2O2誘導的乳鼠心肌細胞的凋亡，當抑制miR-21表達后，抗凋亡效應消失。隨后Cheng等[8]的研究進一步發(fā)現(xiàn)在大鼠心臟缺血預適應24 h后，給予左前降支結扎再灌注，從而導致miR-21表達量的升高，當敲除此時心肌細胞中miR-21的表達，會使缺血預適應的保護效應消失。Sayed等[9]也發(fā)現(xiàn)miR-21能抵抗低氧誘導的心肌細胞凋亡，縮小梗死面積和緩解心衰。從而說明miR-21對各種應激條件下的心肌細胞的保護作用。因而本研究在此基礎上探討miR-21對氧化應激導致的心肌細胞凋亡的影響。

H2O2作為氧化應激模型的常用誘導劑，本研究也采用H2O2來誘導H9c2心肌細胞氧化應激損傷模型，預實驗濃度200 μmol/L與Wang等[10]，鐘源等[11]用于誘導心肌細胞氧化應激模型的作用濃度一樣，因而作為本研究的H2O2誘導濃度。研究結果顯示，H2O2誘導后，心肌細胞中ROS熒光強度及MDA水平顯著提高，SOD水平降低。而miR-21表達量提高后，能提高H2O2誘導的H9c2細胞中SOD水平，降低ROS熒光強度及MDA水平，從而提示miR-21能通過清除細胞內(nèi)氧化應激產(chǎn)物抵抗H2O2誘導的H9c2細胞氧化應激損傷。

心力衰竭、心肌缺血、心肌梗死、心臟重塑、缺血再灌注損傷等心血管疾病不僅能造成心肌細胞膜脂質過氧化，又使DNA斷裂，線粒體受損，最終導致心肌細胞凋亡及壞死，進一步加重疾病的發(fā)展，導致惡性循環(huán)[12-13]。因此，減少心肌細胞凋亡對心血管疾病的治療亦具有重要意義。MTT法及AnnexinV-PI流式雙染結果表明H2O2模型組中心肌細胞活力降低，細胞凋亡率升高，當miR-21表達量提高后，能顯著抑制H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡，與Cheng等[6,8]的觀點一致。提示miR-21能通過抑制細胞凋亡從而抵抗H2O2誘導的H9c2細胞氧化應激損傷。并且在H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡程度提高的同時常伴隨著Bcl-2表達量的下降，Bax、PDCD4表達量的上升[14]。研究已證實PDCD4、Bcl-2是miR-21的靶蛋白，Dong等[15]研究證實急性心肌梗死24 h后，心臟過表達miR-21能顯著縮小心肌梗死面積，是通過靶向下調PDCD4的表達實現(xiàn)的。本研究結果表明miR-21表達量提高后，能顯著提高H2O2誘導的H9c2心肌細胞中Bcl-2表達量，降低PDCD4及Bax表達量。細胞的增殖與凋亡受眾多信號通路調控，PI3K/AKT信號通路就是其中一種，其具有抗凋亡通路之稱，能通過下游多種靶蛋白表達，從而參與調控細胞生長、凋亡、血管生成等過程。PI3K/AKT上游蛋白PTEN是miR-21的下游靶基因。PTEN能將三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化為二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，從而負調控PI3K/AKT信號通路，在細胞凋亡中起重要作用。所以筆者進一步探討造模并轉染后，心肌細胞中PTEN/AKT信號通路的激活情況，結果表明miR-21 mimics能顯著的下調PTEN表達，上調AKT磷酸化水平。

綜上所述，通過瞬時轉染miR-21 mimics，能顯著的抑制H2O2誘導的H9c2心肌細胞氧化應激水平及細胞凋亡程度，與降低ROS熒光強度及MDA水平，提高SOD水平，上調Bcl-2表達，下調PDCD4及Bax表達有關，可能是通過PTEN/AKT信號通路實現(xiàn)的。

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作者簡介：張亞琴(1968-),副主任醫(yī)師，本科,主要從事心內(nèi)科工作。

doi:·經(jīng)驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.033

[中圖分類號]R542.2

[文獻標識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)16-2257-04

(收稿日期：2015-12-21修回日期：2016-03-12)