萬英明,齊　玲,田　晶,劉麗梅

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科　132021；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院　132021)

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STATs蛋白家族在口腔黏膜下纖維化及其并存口腔扁平苔蘚中的表達(dá)及意義

萬英明1,齊玲2,田晶2,劉麗梅1

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科132021；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院132021)

[摘要]目的比較口腔黏膜下纖維化(OSF)、OSF并存扁平苔癬(OLP)及正?？谇火つそM織中STATs蛋白家族的表達(dá)差異,探討STATs蛋白家族在OSF并存OLP發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。方法收集臨床OSF病例21例 (OSF組)、OSF并存OLP13例(OSF并存OLP組)，以及NBM組織10例(對(duì)照組)，分離組織RNA，采用RT-PCR分析STATs蛋白家族(Stat1、Stat2、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6)在OSF不同分期組織及OSF并存OLP組織中的表達(dá)差異。篩選表達(dá)差異較大的基因，進(jìn)行免疫印跡雜交檢測(cè)驗(yàn)證，并分析其磷酸化變化，探討STATs蛋白家族在OSF并存OLP發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。結(jié)果Stat1、Stat3、Stat5a的表達(dá)量與OSF分型呈正相關(guān)，即在OSF組中晚期黏膜組織樣本中的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而Stat2、Stat4、Stat5b、Stat6在不同OSF分型中的表達(dá)量變化不顯著(P>0.05)。Stat1和p-Stat1在OSF并存OLP組中的表達(dá)水平與對(duì)照組比較顯著增加(P<0.05)，Stat3和p-Stat3(Ser727)在OSF并存OLP組中的表達(dá)水平與對(duì)照組比較明顯上調(diào)(P<0.05)。與對(duì)照組比較，Stat5a在OSF并存OLP組中顯著上調(diào)，而p-Stat5a在各組中變化不顯著。結(jié)論STATs蛋白家族成員Stat1、Stat3、Stat5a在OSF及其并存OLP中表達(dá)上調(diào)。

[關(guān)鍵詞]口腔黏膜下纖維化；扁平苔蘚；STATs

口腔黏膜下纖維化(oral submucous fibrosis,OSF) 是一種慢性口腔黏膜疾病，主要病理過程包括固有層的纖維組織變性和上皮萎縮，從而引起黏膜硬化，形成條索，最終引起牙關(guān)緊閉，妨礙口腔各種功能的發(fā)揮，并成為癌前狀態(tài)[1]?？谇槐馄教Π_(oral lichen planus,OLP)是一種慢性、淺在性炎癥的角化性病變，臨床表現(xiàn)包括上皮過度不全角化、上皮釘突形態(tài)不一，甚至伴有糜爛、饋蕩。目前OLP的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，研究表明可能與免疫因素有關(guān)[2-3]。OSF和OLP都被WHO列為口腔癌前狀態(tài)[4-5]。Pindbrog報(bào)道了OSF與OLP并存[6]。在我國(guó)目前OSF并存OLP的發(fā)病率約為6.5%[7]。OSF與OLP并存發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究并不多見，而OSF與OLP并存可以導(dǎo)致患者張口受限、舌運(yùn)動(dòng)障礙甚至吞咽困難，同時(shí)OSF與OLP并存也是一種癌前狀態(tài)，因此研究OSF與OLP并存的發(fā)生機(jī)制具有一定的臨床意義。

STATs蛋白家族由是一種存在于細(xì)胞質(zhì)，激活后能夠轉(zhuǎn)入核內(nèi)，通過分子末端的DNA結(jié)合域與DNA結(jié)合的蛋白家族，能夠與酪氨酸磷酸化信號(hào)通道耦聯(lián)，發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。STATs異常表達(dá)或激活將導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)節(jié)障礙，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[8-9]。已經(jīng)有大量研究表明，STATs的過度表達(dá)或激活存在于多種不同的人類腫瘤組織及細(xì)胞系。

本研究通過收集OSF、OLP病例，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)分析STATs蛋白家族在OSF不同分期組織及OSF并存OLP病例組織中的表達(dá)差異，探討STATs蛋白家族在OSF并存OLP發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1臨床組織樣本按照Pindborg病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)及臨床表現(xiàn)，選擇收集吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院2013年4月至2015年8月就診，并經(jīng)過兩名病理科醫(yī)師光鏡下確診分期病例，OSF病例21例 (OSF早、中、晚期各7例，OSF組)、OSF并存OLP13例(OSF并存OLP組)，以及正?？谇火つそM織10例(對(duì)照組)，組織樣本釆集前均經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者簽署知情同意書?；颊咝詣e及年齡分布見表1。

表1　臨床資料年齡、性別分布

1.1.2藥物試劑及儀器設(shè)備RNA提取試劑盒：購自Ambion(美國(guó))-12183-555；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：購自Applied Biosystems(美國(guó))-4366597；RT-PCR試劑盒：購自Bio-Rad(美國(guó))-172-5264;Ready Prep蛋白質(zhì)萃取試劑盒：購自Bio-Rad(美國(guó))；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒：購自Vazyme Biotech(中國(guó))；Stat1、p-Stat1、Stat3、p-Stat3、Stat5a、p-Stat5a單克隆抗體：購自Santa Cruz Biotechnology(美國(guó));辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗：購自北京中杉金橋生物;ECL Chemiluminescent Substrate Reagent Kit：購自Novex (美國(guó))-WP20005;核酸定量分析儀：Qubit Fluorometer；RT-PCR 檢測(cè)系統(tǒng)：Bio-rad-CFX96 Touch。

1.2方法

1.2.1RT-PCR測(cè)定收集的臨床組織樣本，經(jīng)PBS(Rnase free)清洗并標(biāo)記后儲(chǔ)存于液氮。提取組織總RNA(按照RNA提取試劑盒說明進(jìn)行)。Qubit Fluorometer檢測(cè)RNA水平及純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA,RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因。在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢Stat1、Stat2、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)RT-PCR引物，引物委托上海生工合成。通過測(cè)定每個(gè)基因擴(kuò)增的Ct值，Ct值與DNA起始拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)性，以雙△Ct 值法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平：3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值作為每個(gè)樣本的CT值，△CT =CT(Target Gene)-CT(內(nèi)參)，△△CT= △CT(sample)-△CT (control)，因此目的基因相對(duì)表達(dá)水平=2-△△CT，對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量即為20=1[10]。

1.2.2免疫印跡雜交口腔黏膜組織用RIPA裂解液裂解(加入蛋白酶抑制劑cocktail)，吹打混勻。超聲波裂解細(xì)胞，探針型超聲冰上進(jìn)行適當(dāng)頻率的短促?zèng)_擊，裂解混合物于4 ℃，13 000 r/min離心20 min。吸取上清液于新的離心管中，用Protein Assay Kit測(cè)定蛋白水平。蛋白樣品經(jīng)十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后的凝膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min，裝配轉(zhuǎn)移“三明治”，100 V，45～60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBS漂洗PVDF膜10～15 min；將膜置入含5%(w/v) 脫脂牛奶的TBS/T封閉緩沖液中，室溫?fù)u動(dòng)1 h，加入合適稀釋度的一抗[用含1%(w/v)脫脂牛奶的TBST稀釋]，室溫孵育2 h,TBST漂洗膜3次，每次5～10 min；用含0.05%(w/v)脫脂牛奶的TBST稀釋的二抗(1∶10 000，HRP標(biāo)記)孵育膜，室溫孵育1 h；TBST漂洗膜3次，每次5～10 min。曝光，照相保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Quantity One v4.62軟件分子條帶灰度值(條帶軌跡定量法)，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白的半定量數(shù)值作為定量根據(jù)，并作統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1STATs蛋白家族在不同分期OSF、OSF并存OLP病例中表達(dá)的差異Stat1、Stat3、Stat5a的表達(dá)量與OSF分型呈正相關(guān)，即在OSF組中晚期黏膜組織樣本中的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而Stat2、Stat4、Stat5b、Stat6在不同OSF分型中的表達(dá)量變化不顯著(P>0.05)。Stat1、Stat2、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6在OSF并存OLP組中表達(dá)均高于對(duì)照組，其中Stat1、Stat3、Stat5a、Stat5b變化顯著(P<0.05)，見圖1。

圖1　STATs蛋白家族的表達(dá)差異分析

2.2OSF并存OLP組中Stat1、Stat3、Stat5a的活化狀態(tài)比較根據(jù)RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果，筆者篩選出OSF并存OLP組與對(duì)照組相比，變化顯著的分子(Stat1、Stat3、Stat5a)，免疫印跡雜交檢測(cè)蛋白水平上述分子的變化情況，并進(jìn)一步檢測(cè)其活化形式-磷酸化水平在各組病例中的表達(dá)情況。結(jié)果表明Stat1和p-Stat1在OSF并存OLP組中的表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著增加(P<0.01)，Stat3和p-Stat3(Ser727)在OSF并存OLP組中的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Stat5a在OSF并存OLP組中顯著上調(diào)(與對(duì)照組比較)，而p-Stat5a在各組中變化不顯著(圖2)。

圖2　Stat1、Stat3、Stat5a的磷酸化變化

3討論

OSF是一種慢性、隱匿性的口腔黏膜病，易發(fā)于頰、軟腭、唇、舌、口底、咽等部位，具有癌變傾向，臨床表現(xiàn)主要包括，口腔黏膜上皮增生或萎縮、黏膜下層膠原的堆積和變性，在OSF中、后期出現(xiàn)血管閉塞、開口困難。OSF的具體機(jī)制目前尚不清楚，但咀嚼檳榔、遺傳、免疫反應(yīng)等因素被認(rèn)為是導(dǎo)致OSF的綜合因素，這些因素共同作用導(dǎo)致了OSF的發(fā)生[11-12]。OLP也是常見的慢性口腔黏膜病之一，臨床上可以表現(xiàn)為多種復(fù)雜的聯(lián)合病損，比如丘疹樣的、斑塊樣的以及潰瘍性的病變[13-14]。Pindbrog于1970年報(bào)道OSF與OLP并存[6]，我國(guó)目前OSF并存OLP的發(fā)病率約為6.5%。由于OSF、OLP都被WHO列為癌前狀態(tài)，因此，了解OSF、OLP的具體發(fā)生機(jī)制，對(duì)于預(yù)防治療口腔腫瘤具有一定的指導(dǎo)意義。

從病理改變角度出發(fā)，細(xì)胞外基質(zhì)的降解/合成平衡的紊亂是導(dǎo)致OSF的主要原因，主要的病理改變表現(xiàn)為上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和結(jié)締組織成分和結(jié)構(gòu)的改變兩個(gè)部分[15]。在OSF早期，炎性反應(yīng)是重要的病理表現(xiàn)，隨著病程延續(xù)，大量炎性分子的異常表達(dá)引起核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(TFAP-1)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子STATs的異常激活，并最終引起細(xì)胞凋亡調(diào)控異常[16-17]。上皮過度角化、上皮下固有層淋巴細(xì)胞帶狀浸潤(rùn)及基底層細(xì)胞液化變性是OLP的主要病理特征。研究表明，OLP的發(fā)生與轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)或激活具有相關(guān)性。臨床研究表明OSF并存OLP的病理改變可以同時(shí)具有OSF、OLP的一些基本病理改變，例如在一些部位可以觀察到在OSF病理改變的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了如固有層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)帶、基底細(xì)胞液化變性等OLP的特征性病理改變[18-19]。

STATs蛋白家族由Stat1、Stat2、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6 7個(gè)成員組成，由750～850個(gè)氨基酸組成，成員分子均含有N端結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)構(gòu)域，以及SH2/SH3結(jié)構(gòu)域，以及具有轉(zhuǎn)錄活性功能的結(jié)構(gòu)域。在生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等信號(hào)分子刺激激活后改變構(gòu)型形成二聚體，并在核內(nèi)聚集，結(jié)合特定的靶DNA啟動(dòng)子序列，促進(jìn)相應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)，是腫瘤發(fā)生信號(hào)通路中非常的調(diào)控因子，處于持續(xù)激活狀態(tài)的STATs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[20-21]。本研究表明，Stat1、Stat2、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6在各組病例黏膜組織中的表達(dá)有差異。Stats各成員分子羧基端差異較大，因此具有相對(duì)特異的功能，Stat1、Stat2主要參與了干擾素的信號(hào)傳導(dǎo)，而Stat4和Stat6則主要調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化過程，Stat3、Stat5可以被多種細(xì)胞因子激活，發(fā)揮更加復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Stat1、Stat3、Stat5a的表達(dá)量與OSF分型呈正相關(guān)，即在OSF組中晚期黏膜組織樣本中的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而Stat2、Stat4、 Stat5b、Stat6在不同OSF分型中的表達(dá)量變化不顯著(P>0.05)。進(jìn)一步研究OSF并存OLP組及對(duì)照組中STATs的表達(dá)變化，Stat1、Stat2、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6在OSF并存OLP組中的表達(dá)量均高于對(duì)照組，其中Stat1、Stat3、Stat5a、Stat5b變化顯著(P<0.05)。

磷酸化修飾是Stats家族蛋白重要的翻譯后修飾，JAK-STST信號(hào)通路的激活正是通過磷酸化過程來實(shí)現(xiàn)的[22]。因此，筆者選擇表達(dá)水平變化較大的分子考察其磷酸化變化的水平。與RT-PCR結(jié)果一致，即Stat1在OSF并存OLP組中的表達(dá)水平與對(duì)照組比較顯著增加(P<0.05)，同時(shí)其活化形式p-Stat1在OSF并存OLP組中也顯著上調(diào)，說明在OSF并存OLP狀態(tài)下，Stat1處于異?；罨臓顟B(tài)。Stat3和p-Stat3(Ser727)在OSF并存OLP組中的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，Stat5a在OSF并存OLP組中顯著上調(diào)，而p-Stat5a在各組中變化不顯著。對(duì)于這一結(jié)果，筆者認(rèn)為可能的原因是Stat5a在OSF或OLP過程中表達(dá)量上調(diào)，但其活化過程存在組織特異性，在口腔黏膜組織中發(fā)生磷酸化水平較低。而Stats家族蛋白活化過程在OSF、OLP過程中的具體作用機(jī)制，將是下一步的研究方向。

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作者簡(jiǎn)介：萬英明(1974-)，副主任醫(yī)師,碩士,主要從事口腔修復(fù)學(xué)、口腔種植醫(yī)學(xué)、口腔生物力學(xué)研究工作。

doi:·經(jīng)驗(yàn)交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.032

[中圖分類號(hào)]R246.83

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)16-2254-04

(收稿日期：2015-12-15修回日期：2016-02-26)