李 慧， 李 溪, 胡 婕，周崇松

(湘南學院化學生物與環(huán)境工程學院，湖南郴州 423000)

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綠茶中茶多酚的超聲波法提取工藝及HPLC法測定

李 慧， 李 溪, 胡 婕，周崇松*

(湘南學院化學生物與環(huán)境工程學院，湖南郴州 423000)

摘要[目的] 優(yōu)化綠茶中茶多酚的提取工藝并測定其含量。 [方法]以浙江綠茶為原料，對超聲波輔助法提取茶多酚的條件進行了研究，采用高效液相色譜法測定最佳條件下茶多酚含量并與酒石酸亞鐵吸光光度法的測定結果進行比較。[結果]經(jīng)過單因素和正交試驗得出超聲波提取綠茶中茶多酚的最佳工藝為：以70%的乙醇為提取溶劑，超聲提取溫度為70 ℃，超聲處理25 min，功率為60%(150 W)，提取率為20.87%。浸提物經(jīng)過純化后采用HPLC法測定，其茶多酚含量為18.17%。[結論] 研究可為綠茶在提取工藝的改進和茶多酚在天然解酒藥物方面的應用提供參考。

關鍵詞茶多酚；超聲波；高效液相色譜

茶多酚又名茶單寧、茶鞣質，是茶葉中多酚類物質的總稱[1]。茶多酚具有抗氧化性、抗衰老、抗輻射、抗疾病、清除自由基等生物學功能[2]，其中清除自由基的功能使其在天然解酒藥物的研究中得到應用[3]。

茶多酚提取工藝的研究較多[2]，傳統(tǒng)工藝通常以水或乙醇為溶劑，采用水浴加熱，保溫提取多次，然后再用有機相萃取。該方法的缺點是操作費時繁瑣、溶劑消耗量大、毒性大、成本高、提取率低，在高溫下提取茶多酚易氧化變質[2]。由于超聲波具有獨特的機械粉碎作用和空化效應，當其用于浸提茶多酚作業(yè)時，可以增加物料分子運動頻率和速度，提高物料分子的浸出速度和浸出數(shù)量，可在較低浸提溫度條件下獲得較高的茶多酚提取量，大大縮短了浸提時間，減少了茶多酚的氧化破壞[4-5]。筆者采用以乙醇為溶劑的超聲波浸提法優(yōu)化茶多酚提取工藝，并對比分析了酒石酸亞鐵法和高效液相色譜法[6]對測定茶多酚的影響。試驗采用正交設計法研究了浸提溫度、時間、功率、醇濃度對茶多酚提取率的影響，優(yōu)化了茶多酚提取工藝條件，可推動茶多酚在天然解酒產(chǎn)品方面的應用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及試劑。茶葉，采自浙江省杭州冠品茶葉有限公司；茶多酚對照品，天津西瑪科技有限公司,純度≥98%；無水乙醇、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無水硫酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、氯仿、乙酸、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇，以上均為分析純。

1.1.2主要儀器。KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE52CS旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；L-7000高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2方法茶葉樣品經(jīng)過烘干、粉碎、超聲浸提、離心分離處理，然后進行茶多酚含量的測定[4]。試驗對提取溫度、時間、功率、乙醇濃度4個因素分別進行單因素和正交試驗，優(yōu)化提取工藝條件。

1.2.1茶多酚標準曲線的繪制。配制茶多酚濃度分別為0.016、0.018、0.020、0.022和0.024 mg/mL，以茶多酚濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2乙醇濃度對浸提率的影響。選擇料液比1∶20 g/mL，提取時間為25 min，超聲波功率為60%(150 W)，提取溫度為60 ℃，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，考察乙醇濃度對浸提率的影響。

1.2.3提取時間對浸提率的影響。選擇料液比1∶20 g/mL，超聲波功率為60%(150 W)，提取溫度為60 ℃，乙醇濃度為70%，提取時間分別為15、25、35、45、55 min ，考察提取時間對浸提率的影響。

1.2.4超聲提取功率對浸提率的影響。選擇料液比1∶20 g/mL，提取時間為25 min，提取溫度為60 ℃，乙醇濃度為70%，超聲波功率分別為40%、50%、60%、70%、80%，考察超聲提取功率對提取率的影響。

1.2.5提取溫度對浸提率的影響。 選擇料液比1∶20 g/mL，提取時間為25 min，乙醇濃度為70%，選擇超聲波功率為60%，提取溫度為40、50、60、70、80 ℃，考察提取溫度對提取率的影響。

1.2.6正交試驗設計。在單因素試驗的基礎上，選取乙醇濃度、超聲波功率、超聲波提取時間、提取溫度為主要影響因素，以測定的茶多酚浸提率為指標，進行L16(44)正交試驗，正交試驗因素水平見表1。

表1　L16(44)正交試驗因素水平

1.2.7高效液相色譜測定茶多酚含量。色譜柱條件：Kromasil100-5C18(4.6×250 mm);流動相：乙酸∶甲醇∶N,N-二甲基甲酰胺∶水=1∶1∶40∶58(V/V)；色譜柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測器：紫外可見吸收檢測器；紫外波長：280 nm。

2結果與分析

2.1茶多酚標準曲線由圖1可見，茶多酚標準曲線線性回歸方程為：y=9.9x-0.009 6，R=0.997 1，表明在該范圍內，茶多酚吸光值與質量濃度有良好的線性關系。

圖1　茶多酚標準曲線Fig.1　The standard curve of tea polyphenols

2.2超聲波提取茶多酚的單因素試驗

2.2.1乙醇濃度對浸提率的影響。如圖2所示，當乙醇濃度為50%～90%時，茶多酚提取率先增大再降低，乙醇濃度為80%的時候，提取率最高，但相對于70%時的提取率僅多了0.1百分點，影響不大，考慮到節(jié)約能耗，可以選取70%的乙醇濃度作為提取的最佳濃度。

2.2.2提取時間對浸提率的影響。如圖3所示，在試驗的提取時間范圍內，其對茶多酚含量的影響不是很明顯，但還是可以看出它有一個最佳值，即在25 min時的提取率相對于時間更長的效果更好。所以選擇提取時間25 min為茶多酚提取的最佳提取時間。

2.2.3超聲提取功率對浸提率的影響。如圖4所示，在超聲功率為40%～80%(100～200 W)的范圍內，當超聲波功率在60%(150 W)之后，茶多酚含量不再增加，而且繼續(xù)增大功率可能會導致有效成分中的熱敏性物質結構被破壞和活性降低。因此，選擇超聲波功率為60%(150 W)為最佳提取功率。

2.2.4提取溫度對浸提率的影響。如圖5所示，在試驗溫度范圍內，隨著溫度的升高，茶多酚浸提率在70 ℃出現(xiàn)最大值。因此，選擇溫度為70 ℃時為提取的最佳溫度。

圖2　乙醇濃度對茶多酚提取率的影響Fig.2　Effect of ethanol concentration on the yield of tea polyphenols

圖3　提取時間對茶多酚提取率的影響Fig.3　Effect of extraction time on the yield of tea polyphenols

圖4　超聲提取功率對茶多酚提取率的影響Fig.4 　Effect of ultrasonic power on the yield of tea polyphenols

圖5　提取溫度對茶多酚提取率的影響Fig.5　Effect of temperature on the yield of tea polyphenols

2.3正交試驗由表2可以看出，以茶多酚浸提率為指標，4個影響因素對浸提率的影響大小依次為A、D、C、B，即超聲提取的溫度影響最大，其次是乙醇濃度和超聲功率，最后是提取的時間。正交試驗的最優(yōu)組合為A3B1C2D4，但從成本和提取效率綜合考慮，選取出的最優(yōu)組合為A3B1C2D3，即提取溫度為70 ℃，超聲處理25 min，功率為60%(150 W)，乙醇濃度為70%。

表2　茶多酚含量測定正交試驗結果

2.4優(yōu)化工藝的驗證試驗采用優(yōu)化工藝條件：超聲提取溫度70 ℃，超聲處理25 min，功率為60%(150 W)和乙醇濃度為70%進行3次平行試驗，結果見表3。得到茶多酚平均浸提率為20.87%，RSD=0.17%，表明該工藝的重現(xiàn)性好，達到了優(yōu)化的目的。

表3茶多酚最佳工藝條件驗證

Table 3Verification of the optimum conditions for tea polyphenols

編號No.吸光度Absorb-ance浸提率Yield%相對標準偏差(RSD)Relativestandarddeviation∥%平均浸提率Averageyield∥%10.15620.910.1720.8720.15420.6630.15721.04

2.5高效液相色譜測定茶多酚含量準確稱取20 mg茶多酚標準品，用少量乙酸乙酯溶解后定容25 mL作為茶多酚標準儲備液。分別精確移取0.7、1.3、1.9、2.5、3.1、3.7于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容。分別通過0.45 μm微孔濾膜過濾。每個樣品濃度進樣2次，每次進樣量10 μL，以峰面積—茶多酚濃度繪制標準曲線(圖6)。

圖6　茶多酚的HPLC標準曲線Fig.6　HPLC standard curve of tea polyphenols

按色譜條件對標準品進行分析，EGCG、EC、EGC與ECG混合物的保留時間分別為4.357、5.057、5.815 min。茶多酚標準品的高效液相色譜見圖7。

取最佳條件所得的提取液，純化處理、減壓濃縮至50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容成儲備液。從儲備液中取2.5 mL稀釋到20 mL，稀釋液在色譜條件下進樣3次，每次進樣10 μL，提取液的色譜圖見圖8。求出3次積分面積的平均值，由標準曲線公式計算得出提取液中茶多酚含量為18.17%。

圖7　茶多酚標準品的HPLC色譜Fig.7　HPLC chromatogram of tea polyphenols

圖8　提取液的高效液相色譜Fig.8　HPLC chromatogram of extract

3結論與討論

該試驗得出用超聲輔助法提取綠茶中茶多酚的最佳優(yōu)化工藝條件為：以70%的乙醇為提取溶劑，超聲提取溫度為70 ℃，超聲處理25min，功率為60%(150W)。采用酒石酸亞鐵分光光度計法[7]測得最佳浸提率為20.87%，與于淑池等用微波提取安吉白茶中茶多酚得率20.70%相吻合[1]；與朱鑫鑫等研究的超聲波浸提條件非常接近，兩者的微小差異可能是由于超聲波的功率不同造成的[2]；符合呂生等提出的生茶中茶多酚質量分數(shù)超過20%的觀點[8]。

該試驗浸提液純化后采用HPLC法測定茶多酚的純度[9]，對照標準品得提取產(chǎn)品中茶多酚含量為18.17%。

超聲波輔助法提取工藝極大地縮短了提取時間，且提高了浸提率，可廣泛應用于從茶葉中提取茶多酚，從而推動茶多酚在天然解酒產(chǎn)品制備工藝的發(fā)展。

參考文獻

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[2] 朱鑫鑫, 熊志勇, 汪烈焰.超聲波協(xié)助提取茶多酚的工藝研究[J].廣東化工, 2011，38(7):291-292.

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基金項目湖南省教育廳科學研究項目(13C897)；湖南省大學生研究性學習及創(chuàng)新性實驗項目(湘教通[2014]248號，484)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(教高司函[2014]58號，8778)。

作者簡介李慧(1994- )，女，湖南攸縣人，本科生，專業(yè)：應用化學。 *通訊作者，講師，博士，從事理論與計算化學研究。

收稿日期2016-03-22

中圖分類號S 571.1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-080-03

The Extraction Conditions with Ultrasound and the HPLC Mensuration of Tea Polyphenols

LI Hui, LI Xi, HU Jie, ZHOU Chong-song*

(School of Chemical Biology and Environmental Engineering, Xiangnan University, Chenzhou, Hunan 423000)

Abstract[Objective] The aim was to optimize extraction technique of tea polyphenols and determine its content.[Method] Taking Zhejiang green tea as raw material, the extraction of tea polyphenols by ultrasonic assisted method was studied.The content of tea polyphenols under the optimal conditions was determined by HPLC method, and was compared with the results determined by spectrophotometry.[Result] Through single factor and orthogonal experiments the optimal conditions of soaking tea polyphenols were determined as follows:70% ethanol concentration as solvent, ultrasonicwave extraction temperature at 70 ℃, extraction time of 25 min and the ultrasonicwave power with 60%(150 W), and the yield of tea polyphenols was 20.87%.The content of tea polyphenols was 18.17% by HPLC method after purification.[Conclusion] The study can provide a reference for improvement of green tea in extraction technique and application of tea polyphenols in natural hangover drug.

Key wordsTea polyphenols; Ultrasonic; HPLC