(Taigu Biotechnology Limited Liability Company in Hunan Province/ Key Laboratory of Plant Nutrient and Bio-fertilizer, Ministry of Agriculture, Changsha 410205, China)

YI Zi-ting, LUO Zhi-wei, XU Tao-ming, ZHOU Fang-ru, FENG Lai*

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Optimization of Fermentation Process for HalotolerantBacillussubtilisTGBio-1433

(Taigu Biotechnology Limited Liability Company in Hunan Province/ Key Laboratory of Plant Nutrient and Bio-fertilizer, Ministry of Agriculture, Changsha 410205, China)

Abstract：Fermentation medium and conditions ofBacillussubtilisTGBio-1433 were investigated, in order to obtain a higher concentration of bacteria, the fed-batch fermentation ofBacillussubtilisTGBio-1433 were also explored. The results showed that the optimal combination for fermentation was as follows: corn flour 10 g/L, soybean meal 20 g/L, glucose 15 g/L, peptone 15 g/L, beef paste 5 g/L, MgSO41 g/L, CaCO37 g/L. The optimum for fermentation conditions was as follows: the initial pH 7.0～7.5, incubation temperature 35 ℃, incubation time18～20 h , inoculums concentration 5%. Fed-batch fermentation process was as follows: after 16 h fermentation, adding carbon and nitrogen source (glucose∶peptone ∶beef paste = 3∶3 ∶1) 15% of the total one-off. The concentration ofBacillussubtilisTGBio-1433 from the original 24.2×108cfu/mL up to 136.1×108cfu/mL.

Key words：Halotolerant microorganism; Fermentation optimization; Fed-batch fermentation;Bacillussubtilis

由于特定氣候、地質(zhì)條件造成我國(guó)鹽漬土壤眾多，而生態(tài)破壞、不合理的灌溉方式又加劇了土壤鹽化[1]。如何利用這些鹽漬化土壤發(fā)展可持續(xù)農(nóng)、林業(yè)，是目前我國(guó)亟待解決的問(wèn)題。

在利用水利工程措施、化學(xué)改良措施等傳統(tǒng)方法改良鹽漬化土壤的同時(shí), 研究者已經(jīng)普遍認(rèn)識(shí)到生物修復(fù)是最有效的改良方式之一[2]。20世紀(jì)70年代初，相關(guān)研究表明耐鹽菌能增強(qiáng)作物耐鹽性[3]。微生物菌肥中含有大量的有益微生物和有機(jī)質(zhì)，有機(jī)質(zhì)在分解過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸，能夠改善土壤理化性質(zhì)、提升土壤微生物活性，是改良鹽漬化土壤的有效途徑之一[4]。其中，枯草芽孢桿菌是植物根際土壤微生物的優(yōu)勢(shì)種群[5]，在植物促生長(zhǎng)、病害防治以及土壤修復(fù)方面都有天然優(yōu)勢(shì)[6-7]。本文研究了一株分離于微生物菌肥生產(chǎn)過(guò)程的耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件，為進(jìn)一步的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌種耐鹽枯草芽孢桿菌TGBio-1433，由農(nóng)業(yè)部植物營(yíng)養(yǎng)與生物肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

1.1.2主要原料玉米粉、豆粕粉均為市售，過(guò)60目篩。

1.1.3培養(yǎng)基活化培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基；種子液培養(yǎng)基：活化培養(yǎng)基中除去瓊脂?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10 g/L、豆粕粉20 g/L、MgSO41 g/L、CaCO37 g/L。

1.1.4儀器設(shè)備大容量全溫振蕩器DHZ-D，雙人凈化工作臺(tái)SW-CJ-2D，生化培養(yǎng)箱LRH-150。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加優(yōu)質(zhì)碳、氮源，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)添加的碳、氮源種類(lèi)含量進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)，測(cè)定活菌數(shù)；以活菌數(shù)的多少作為培養(yǎng)基優(yōu)化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.2.1接種量對(duì)生長(zhǎng)量的影響選取3%、5%、7%、9%接種量，在35 ℃、pH 7.0、140 r/min搖瓶下培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

1.2.2.2培養(yǎng)溫度對(duì)生長(zhǎng)量的影響選取30、32、35、37 ℃ 4個(gè)溫度，在pH 7.0、140 r/min搖瓶下培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

1.2.2.3起始pH對(duì)生長(zhǎng)量的影響將起始pH分別設(shè)為6.5、7.0、7.5、8.0，在35 ℃、140 r/min搖瓶下培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

1.2.2.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生長(zhǎng)量的影響接種6 h后，毎2 h取樣測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)，接種量3%，在35 ℃、pH 7.0、140 r/min搖瓶下培養(yǎng)。

1.2.3補(bǔ)料分批發(fā)酵優(yōu)化

1.2.3.1不同含量補(bǔ)料液對(duì)生長(zhǎng)量的影響在發(fā)酵進(jìn)入對(duì)數(shù)期后，進(jìn)行碳、氮源的一次性補(bǔ)加，補(bǔ)料量分別為培養(yǎng)基中碳、氮源總含量的5%、10%、15%、20%，碳、氮源組成為發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中選定的碳、氮源，對(duì)照不進(jìn)行補(bǔ)加。調(diào)整起始發(fā)酵培養(yǎng)基中碳、氮源含量和培養(yǎng)基體積，使得補(bǔ)料后，培養(yǎng)基碳、氮源總含量、培養(yǎng)基總體積相同。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

1.2.3.2不同補(bǔ)加時(shí)間對(duì)生長(zhǎng)量的影響在確定補(bǔ)料量后，在發(fā)酵對(duì)數(shù)期中選取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)料，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1添加不同碳源對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響在培養(yǎng)基中分別添加5 g/L葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，發(fā)酵24 h后測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

如圖1所示，添加碳源葡萄糖的發(fā)酵液活菌數(shù)最高，其次為蔗糖，再次為可溶性淀粉，3種碳源對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵水平均有不同程度的提高。雖然蔗糖、可溶性淀粉是相對(duì)廉價(jià)的生產(chǎn)原料，但葡萄糖對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵24 h活菌數(shù)的提高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蔗糖、可溶性淀粉，因此，選擇葡萄糖作為耐鹽枯草芽孢桿菌的最佳碳源。

2.1.2添加不同氮源對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響在培養(yǎng)基中分別添加5 g/L蛋白胨、牛肉膏、酵母粉，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，發(fā)酵24 h后測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

如圖2所示，添加氮源牛肉膏的發(fā)酵液活菌數(shù)最高，其次為蛋白胨，再次為酵母粉。添加蛋白胨、牛肉膏對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)提高程度非常相近?？紤]到碳、氮源之間可能存在交互作用，因此，選擇蛋白胨、牛肉膏與葡萄糖進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1　不同碳源對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響

圖2　不同氮源對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響

2.1.3正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)選擇了葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏3個(gè)因素作為研究對(duì)象。設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交試驗(yàn)L9(3)4，優(yōu)化耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基。試驗(yàn)中設(shè)定葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏的3個(gè)水平均為0.5%、1.0%、1.5%。

按正交表L9(3)4進(jìn)行了發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。根據(jù)表1進(jìn)行極差比較和水平、組合選優(yōu)，得出以下結(jié)果：3個(gè)因素的極差大小關(guān)系為：|R|葡萄糖>|R|牛肉膏>|R|蛋白胨>|R|空白。由此可得出，葡萄糖對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌的發(fā)酵水平影響最大，其次為牛肉膏，再次是蛋白胨。

比較葡萄糖3個(gè)水平發(fā)酵液平均活菌數(shù)，發(fā)現(xiàn)x3最大，所以選擇1.5%水平為最優(yōu)；同理牛肉膏選擇0.5%水平為最優(yōu)；蛋白胨選擇1.5%水平為最優(yōu)。所以得到的最優(yōu)組合為：A3B1C3，即玉米粉10 g/L、豆粕粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉膏5 g/L、MgSO41 g/L、CaCO37 g/L。在此最優(yōu)培養(yǎng)基上能收獲最大的耐鹽枯草芽孢桿菌生物量。

2.2發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1接種量對(duì)生長(zhǎng)量的影響由圖3可知，當(dāng)接種量為5%時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最大，因此，耐鹽枯草芽孢桿菌最適接種量為5%。

表1　L9(3)4正交試驗(yàn)結(jié)果

圖3　不同接種量對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響

2.2.2溫度對(duì)生長(zhǎng)量的影響由圖4可知，在30～35 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液活菌數(shù)升高。在35 ℃時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最大，高于35 ℃時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)出現(xiàn)略微下降，因此，耐鹽枯草芽孢桿菌的最適發(fā)酵溫度為35 ℃。

2.2.3起始pH對(duì)生長(zhǎng)量的影響由圖5可知，調(diào)節(jié)起始發(fā)酵pH在7.0～7.5范圍內(nèi)有利于收獲高密度的耐鹽枯草芽孢桿菌活菌。

2.2.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生長(zhǎng)量的影響由圖6可知，在耐鹽枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，8～18 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18 h以后開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。因此，為了獲得最大活菌數(shù)，縮短發(fā)酵周期，選擇18～20 h培養(yǎng)時(shí)間為宜。

2.3補(bǔ)料分批發(fā)酵優(yōu)化

2.3.1不同含量補(bǔ)料液對(duì)生長(zhǎng)量的影響由圖7可知，對(duì)數(shù)期補(bǔ)加不同含量補(bǔ)料，耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)均較對(duì)照45.2×108cfu/mL有所提高。其中補(bǔ)料量為15%時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，達(dá)123.1×108cfu/mL，是對(duì)照的2.7倍，因此，發(fā)酵進(jìn)入對(duì)數(shù)期后補(bǔ)料量為15%時(shí)，對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵最好。

圖4　不同溫度對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響

圖5　不同起始pH值對(duì)耐鹽枯草

圖6　不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響

2.3.2不同補(bǔ)加時(shí)間對(duì)生長(zhǎng)量的影響由圖8可知，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期選取的3個(gè)補(bǔ)料時(shí)間8、12、16 h中，發(fā)酵16 h后補(bǔ)料發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為136.1×108cfu/mL。

3結(jié)論

對(duì)1株耐鹽枯草芽孢桿菌進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件優(yōu)化，通過(guò)稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其培養(yǎng)20 h后的活菌數(shù)，以活菌數(shù)的高低作為評(píng)價(jià)培養(yǎng)基優(yōu)劣的指標(biāo)。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：玉米粉10 g/L、豆粕粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉膏5 g/L、MgSO41 g/L、CaCO37 g/L；培養(yǎng)條件為：起始pH 7.0～7.5，發(fā)酵溫度35 ℃，培養(yǎng)時(shí)間18～20 h，接種量5%；耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)由優(yōu)化前的24×108cfu/mL提高到55×108cfu/mL。

圖7　不同補(bǔ)料量對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響

圖8　不同補(bǔ)料時(shí)間對(duì)耐鹽枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響

為了獲得更高密度的活菌數(shù)，采用補(bǔ)料分批發(fā)酵技術(shù)，在發(fā)酵進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后補(bǔ)加碳、氮源(葡萄糖∶蛋白胨∶牛肉膏=3∶3∶1)，補(bǔ)加量為總量的15%，補(bǔ)加方式為發(fā)酵16 h后一次性補(bǔ)加，耐鹽枯草芽孢桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)由分批培養(yǎng)的24.2×108cfu/mL提高到136.1×108cfu/mL。

目前，補(bǔ)料發(fā)酵已經(jīng)被越來(lái)越多地應(yīng)用，是進(jìn)行高密度發(fā)酵的一個(gè)重要技術(shù)手段。在補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中，前期可減少高濃度底物的反饋抑制，后期又能補(bǔ)充充足的營(yíng)養(yǎng)生產(chǎn)生物量或產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上，研究者又探索了分段補(bǔ)料[8]、間歇補(bǔ)料[9]等發(fā)酵方式，來(lái)進(jìn)一步精細(xì)控制發(fā)酵過(guò)程，最大化提高產(chǎn)物量。

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(責(zé)任編輯：許晶晶)

YI Zi-ting, LUO Zhi-wei, XU Tao-ming, ZHOU Fang-ru, FENG Lai*

關(guān)鍵詞：耐鹽微生物；發(fā)酵優(yōu)化；補(bǔ)料分批發(fā)酵；枯草芽孢桿菌

摘要：對(duì)1株耐鹽枯草芽孢桿菌TGBio-1433培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化；為了獲得更高的菌體濃度，還探索了枯草芽孢桿菌TGBio-1433補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)基為：玉米粉10 g/L、豆粕粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉膏5 g/L、MgSO41 g/L、CaCO37 g/L。最優(yōu)培養(yǎng)條件為：起始pH 7.0～7.5，發(fā)酵溫度35 ℃，培養(yǎng)時(shí)間18～20 h，接種量5%補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝為：發(fā)酵16 h后，一次性補(bǔ)加碳、氮源(葡萄糖∶蛋白胨∶牛肉膏=3∶3∶1)總量的15%?？莶菅挎邨U菌TGBio-1433發(fā)酵液活菌數(shù)由最初的24.2×108cfu/mL提高到136.1×108cfu/mL。

收稿日期：2015-10-28

作者簡(jiǎn)介：易子霆(1989—)，男，湖南邵陽(yáng)人，碩士，主要從事資源微生物篩選與利用方面研究。*通訊作1株耐鹽枯草芽孢桿菌TGBio-1433發(fā)酵工藝優(yōu)化易子霆，羅志威，徐滔明，周芳如，豐 來(lái)*者：豐來(lái)。

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-8581(2016)06-0105-04

(湖南泰谷生物科技股份有限公司/農(nóng)業(yè)部 植物營(yíng)養(yǎng)與生物肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410205)