張俊杰，楊　旭，張文葉，劉崇懷（.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州45000；.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

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河南太行山區(qū)野生山葡萄表皮酵母菌的分離與鑒定

張俊杰1，楊旭1，張文葉1，劉崇懷2
（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

摘要：為了獲取更多的野生酵母優(yōu)質(zhì)菌種資源，本研究采用傳統(tǒng)的微生物分離手段，從河南輝縣太行山區(qū)的野生葡萄表皮共分離純化得到6株酵母菌（W1—W6）。首先采用形態(tài)學(xué)觀察方法對(duì)其進(jìn)行初步分類，然后采用26S rDNA D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)6株酵母菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。形態(tài)學(xué)初步鑒定結(jié)果表明，6株酵母菌呈現(xiàn)出菌落形態(tài)、細(xì)胞顯微形態(tài)、子囊孢子形態(tài)和液體生長(zhǎng)特征的多樣性，并初步歸為5個(gè)形態(tài)學(xué)群；而26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析結(jié)果表明，6株供試菌分別屬于酵母菌4個(gè)屬的5個(gè)種：Hanseniaspora uvarum（W1）、Metschnikowia pulcherrima（W2）、Metschnikowia fructicola（W3）、Debaryomyces hansenii（W4和W6）和Pichia fermentans（W5）。該結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，共同確定了對(duì)6株酵母菌菌株的鑒定結(jié)果。該結(jié)果也豐富了對(duì)野生山葡萄蘊(yùn)含酵母菌資源的認(rèn)識(shí)。

關(guān)鍵詞：微生物；野生山葡萄；酵母菌；26S rDNAD1/D2；分離鑒定

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-04；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1335.002.html。

我國葡萄種植分布廣泛，由于不同產(chǎn)區(qū)的生態(tài)條件差異較大，葡萄品種較多，其所含酵母菌種類也有較大差異［1］。葡萄酒釀造是一個(gè)復(fù)雜的微生物代謝過程，其中酵母菌是最重要的微生物菌群［2］。酵母作為主要的發(fā)酵微生物不僅對(duì)葡萄酒質(zhì)量和發(fā)酵過程影響很大，而且對(duì)葡萄酒色澤、香氣、感官質(zhì)量及風(fēng)格的形成有重要貢獻(xiàn)。用不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒，其酒質(zhì)和風(fēng)味差別很大。所以尋找能夠適應(yīng)當(dāng)?shù)仄咸言咸匦裕⑶矣欣谛纬傻赜蚱咸丫骑L(fēng)格的新土著酵母菌株及新酵母種已成為研究的焦點(diǎn)［3］。酵母菌是葡萄酒釀造的關(guān)鍵因素之一，其遺傳多樣性分析和分類鑒定是選育優(yōu)良釀酒酵母菌種的重要基礎(chǔ)［4-5］。但并非所有酵母菌都能夠起到有益的作用，在一些野生的葡萄中還可能含有亟待開發(fā)的優(yōu)質(zhì)釀酒酵母種群。因此，鑒定腐敗葡萄中酵母菌的種類，有助于抑制葡萄中敗壞性酵母的負(fù)面影響［1］，而鑒定野生葡萄中的酵母菌種群，則有利于發(fā)現(xiàn)更多優(yōu)質(zhì)的釀酒酵母，為我國葡萄酒釀造積累更多的酵母菌種資源。

葡萄酒相關(guān)酵母迄今為止已發(fā)現(xiàn)有20多個(gè)屬的百余種，幾乎遍及酵母的主要屬種［3］。受到環(huán)境因素的影響，某些酵母菌屬、種在形態(tài)學(xué)及生理生化特性方面的差異并不顯著，采用傳統(tǒng)方法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確分類就顯得相當(dāng)困難［6］。隨著DNA序列分析技術(shù)的日趨成熟和簡(jiǎn)化，rRNA基因（rDNA）序列分析已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于酵母菌的鑒定。大亞基rRNA基因（26S rDNA）中的D1/D2區(qū)域，能將絕大部分子囊菌酵母和擔(dān)子菌酵母的種屬區(qū)分開來，而種內(nèi)不同菌株間D1/D2區(qū)域序列差異一般在1%以內(nèi)，堿基差異在1%以上則可能代表著不同的種，由此對(duì)酵母進(jìn)行鑒定分類［7］。

本實(shí)驗(yàn)以河南輝縣太行山區(qū)野生山葡萄為原料，采用形態(tài)學(xué)和26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析相結(jié)合的方法，對(duì)從葡萄表皮分離得到的6株酵母菌進(jìn)行了表型及分子鑒定，為葡萄表皮酵母菌的檢測(cè)和鑒定提供參考，也為選育優(yōu)良的野生葡萄優(yōu)質(zhì)酵母菌種資源提供了理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

采自河南省輝縣太行山區(qū)的野生山葡萄。

1.1.2主要藥品和試劑

葡萄糖、酵母粉、瓊脂、孔雀綠、番紅、碘液、蛋白胨、Taq酶、dNTP、1kb DNA Ladder、酵母基因組提取試劑盒等。

26S rDNA引物：NL-1（5'-GCA TAT CAA TAA GCGGAG GAA AAG- 3'）和NL- 4（5'- GGT CCG TGT TTCAAGACG G-3'）。

1.1.3培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、酵母膏10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，自然pH值。

麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基：葡萄糖1 g、KCl 1.8 g、酵母膏2.5 g、醋酸鈉8.2 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，自然pH值。

WL培養(yǎng)基：酵母浸粉4 g、胰蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、磷酸二氫鉀0.055 g、氯化鉀0.425 g、氯化鈣0.125 g、硫酸鎂0.125 g、氯化鐵0.0025 g、硫酸錳0.0025 g、溴甲酚綠2.2 g、瓊脂20 g，pH6.5。

1.1.4主要設(shè)備與儀器

立式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、恒溫水浴鍋、電泳儀、搖床等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酵母菌的分離純化

首先將完整無破損的葡萄粒放入盛有無菌水的三角瓶中，然后在搖床上振蕩0.5 h，超凈工作臺(tái)內(nèi)吸取三角瓶?jī)?nèi)的振蕩液并做10倍梯度稀釋到10-2，在含有100 mg/L氯霉素的YEPD培養(yǎng)基上涂布，最后在28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d。然后隨機(jī)挑取不同形態(tài)的菌落在含有100 mg/L氯霉素的YEPD培養(yǎng)基平板上劃線純化培養(yǎng)3～5 d，然后隨機(jī)挑選單菌落在光學(xué)顯微鏡下確認(rèn)其純度，并從形態(tài)學(xué)角度初步判斷其是否具有酵母菌的細(xì)胞顯微特征，對(duì)于陽性的菌體首先劃線保存于YEPD固體斜面，備用。

1.2.2酵母菌的菌落形態(tài)觀察

將分離純化的菌種在YEPD平板上劃線并在28℃下活化培養(yǎng)1～2 d，將活化的菌株接種于WL培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)5 d后觀察記錄菌落顏色和形態(tài)，按菌落不同形態(tài)特征對(duì)菌株進(jìn)行初步分類。

1.2.3酵母菌細(xì)胞顯微形態(tài)觀察

取在WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板上的菌落制成菌懸液，取干凈滅菌的載玻片，在中央滴上1滴菌懸液，蓋上蓋玻片，在酒精燈上方微微加熱，干燥固定；然后在蓋玻片的一側(cè)滴加碘液，在另一側(cè)用濾紙吸去多余的水，碘液會(huì)順著水流方向浸入蓋玻片下，直到將多余的碘液吸完，制片完成，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察酵母菌細(xì)胞的顯微形態(tài)。

同時(shí)，將活化的菌種接種于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)2～3 d后，進(jìn)行染色觀察菌體細(xì)胞的顯微形態(tài)及是否有子囊孢子產(chǎn)生。將在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)后的菌種制成菌懸液涂片，并干燥固定；在涂片上滴加數(shù)滴5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，染色1～2 min后用95%vol乙醇沖洗，再立即用水沖去染液；之后用0.5%番紅水溶液復(fù)染0.5～1 min，水洗干燥；將干燥后的涂片用油鏡觀察，分辨菌體及孢子，其中孢子為綠色，菌體和孢子囊為紅色。

1.2.4酵母菌液體培養(yǎng)特征觀察

挑取活化好的菌體接種到裝有40 mLYEPD液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，28℃靜置培養(yǎng)3 d，觀察并記錄底部有無沉淀，是否產(chǎn)生菌璞，是否沿試管壁向上生長(zhǎng)。室溫下繼續(xù)培養(yǎng)4周后再次觀察并記錄特征。

1.2.5酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列的PCR擴(kuò)增、檢測(cè)及序列測(cè)定

酵母菌的DNA提取按照試劑盒說明書進(jìn)行提取。用引物NL-1（5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAGGAA AAG-3'）和NL-4（5'-GGT CCG TGT TTC AAGACG G-3'）對(duì)菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 20 s；循環(huán)36次；再72℃延伸8 min，-20℃保存。PCR反應(yīng)采用50 μL反應(yīng)體系：每管中含PCR緩沖液（10×）5.0 μL；25 mM MgCl223.0 μL；10 mM dNTP 1.0 μL；10 μM NL1和NL4各1 μL；0.5 U/μL DNA聚合酶3 μL；模板DNA 1.0 μL；最后添加ddH2O定容到50 μL。

取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×上樣緩沖液混勻后點(diǎn)樣到1%的瓊脂糖凝膠（已加入Goldview I型核酸染液），然后在100 V電壓下，1×TAE電泳緩沖液中電泳30 min，最后在紫外分析儀上檢測(cè)并初步判斷擴(kuò)增片段的質(zhì)量和大小。擴(kuò)增合格的PCR產(chǎn)物送測(cè)定。

1.2.6序列的分子系統(tǒng)學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果采用DNAman軟件進(jìn)行序列校正，校正后的26S rDNA基因D1/D2區(qū)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索比對(duì)（BLAST）。獲得同源酵母菌株的D1/ D2區(qū)序列后，用MEGA6軟件的ClustalW功能對(duì)所有供試序列進(jìn)行匹配排列，然后采用Kimura 2-parameter模型構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，該分析進(jìn)行1000次的Bootstraps檢驗(yàn)。

1.2.7菌種的保藏

菌種的保藏采用甘油冷凍法。首先，將經(jīng)過純化和形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定的酵母菌菌株從斜面接種到Y(jié)EPD固體平板活化，然后挑取單菌落接種至YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將菌液與50%的無菌甘油以1∶1（體積比）混合于2 mL無菌甘油凍存管中，最后置于-80℃超低溫冰箱中保藏。

2結(jié)果與分析

2.1酵母菌的分離純化及形態(tài)學(xué)初步鑒定

本實(shí)驗(yàn)以太行山區(qū)野生葡萄為材料，經(jīng)過對(duì)葡萄表皮酵母菌株的分離純化，并在WL培養(yǎng)基上通過表型比較，共得到6株代表菌株，分別編號(hào)為W1、W2、W3、W4、W5和W6；通過WL培養(yǎng)基和麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基對(duì)其一系列形態(tài)特征的觀察與描述結(jié)果，見圖1和表1。

從圖1可知，6株供試菌株呈現(xiàn)出5種不同的菌落形態(tài)，其中W4和W6菌落形態(tài)一致，可以推測(cè)2株菌可能屬于同一個(gè)酵母菌種群；其余4株菌呈現(xiàn)不同的菌落形態(tài)，區(qū)別明顯。

從表1可知，對(duì)于液體培養(yǎng)特征，W1、W4、W5和W6在液體培養(yǎng)中都形成膜璞，但是W1和W6形成的膜璞較弱，而W4和W5則形成較強(qiáng)的膜璞；W2和W3則沒有膜璞的產(chǎn)生。對(duì)于菌株的細(xì)胞形態(tài)特征，有圓形、圓形橢圓、橢圓棒狀和檸檬形4種；而就麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上產(chǎn)子囊孢子的觀察結(jié)果，6株菌都可以產(chǎn)生子囊孢子，但是W1—W3子囊孢子產(chǎn)量較少，而W4—W6則產(chǎn)生較多的子囊孢子。通過以上結(jié)果，可以初步把6株酵母菌歸為5個(gè)不同的種群，其中W4和W6屬于同一個(gè)種群。

圖1　　代表性酵母菌株在WL培養(yǎng)基上菌落特征（左）及顯微形態(tài)（右）

表1　代表性酵母菌株的形態(tài)特征

2.2 26S rDNAD1/D2區(qū)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

對(duì)6株代表性酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，所得的序列通過BLAST搜索比對(duì)得出與它們關(guān)系最近的參比酵母菌株的相關(guān)序列及常見酵母菌的相關(guān)序列，通過Mega 6進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建NJ樹，見圖2。由圖2可知，分離得到的6株酵母菌分別與來自4個(gè)不同酵母菌屬的已知菌株聚群。其中W1與Hanseniaspora（漢遜酵母屬）的菌株聚為一群，并且與菌株Hanseniaspora uvarum JJZ3（NCBI登錄號(hào)：JQ678681）相似性為100%，由此可以判定W1屬于種群Hanseniaspora uvarum；W2 和W3都與來自Metschnikowia（梅奇酵母屬）的菌株聚為一種群，但是W2與菌株Metschnikowia pulcherrima D77 2（HM627131）聚為一個(gè)分支，相似性為99.7%，而W3則與菌株Metschnikowia fructicola（KP171590）聚為一個(gè)分支，相似性為99.5%，由此判定W2和W3分別屬于已知酵母種群Metschnikowia pulcherrima和Metschnikowia fructicola；W4和W6共同與Debaryomyces（德巴利氏酵母屬）的菌株Debaryomyces hansenii YE-10（JQ771740）和Debaryomyces hansenii CCFEE 5619（JX124721）聚為同一種群，相似性為100%，由此斷定W4和W6屬于已知種群Debaryomyces hansenii；W5則與Pichia（畢赤酵母屬）的菌株聚為同一種群，其中與Pichia fermentans YS118 （AM882677）聚為一個(gè)分支，相似性為100%，由此判定W5屬于已知種群Pichia fermentans。所以，供試的6個(gè)代表菌株分別歸屬于已知的4個(gè)不同的酵母菌屬和5個(gè)不同的酵母菌種群。

3討論與展望

對(duì)于酵母菌菌種的鑒定已經(jīng)從傳統(tǒng)的宏觀和微觀形態(tài)學(xué)及生理學(xué)鑒定發(fā)展到今天的分子生物學(xué)鑒定方法，這正是得益于分子生物學(xué)的飛速發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)從河南輝縣太行山區(qū)野生山葡萄表皮分離得到了6株酵母菌，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，最終確定6株酵母菌分屬于Hanseniaspora、Metschnikowia、Debaryomyces和Pichia 4個(gè)酵母菌已知屬，并且分別歸屬于Hanseniaspora uvarum（W1）、Metschnikowia pulcherrima（W2）、Metschnikowia fructicola（W3）、Debaryomyces hansenii（W4和W6）和Pichia fermentans（W5）5個(gè)已知酵母菌種群。通過與表1中的菌落形態(tài)描述比較發(fā)現(xiàn)，盡管W4和W6屬于同一個(gè)種群，但是在液體培養(yǎng)基中的特征存在一定的差異，可以推測(cè)兩者屬于兩個(gè)不同的菌株；W2和W3屬于同一個(gè)屬的兩個(gè)不同種群，所以其形態(tài)特征也有比較顯著的差異；同時(shí)，通過縱向比較發(fā)現(xiàn)，來自5個(gè)不同種群的菌株，它們?cè)谛螒B(tài)特征上也存在著明顯的差異，所以，只有把傳統(tǒng)的鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定方法相結(jié)合，才可以更加全面有效和準(zhǔn)確的對(duì)未知酵母菌菌株進(jìn)行分類鑒定。

圖2　　基于26S rDNAD1/D2區(qū)序列的NJ發(fā)育樹分析結(jié)果

酵母菌分類學(xué)方法向著簡(jiǎn)便、快捷、高效和合理的方向發(fā)展，隨著大量酵母菌26S rDNAD1/D2區(qū)序列在Genbank等核酸數(shù)據(jù)庫的公開，26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析技術(shù)目前已經(jīng)廣泛用于酵母菌菌株的鑒定［8-9］。王潔等［1］利用形態(tài)、生理生化特征和26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析方法對(duì)4株腐敗葡萄中的酵母菌進(jìn)行了鑒定，確定4株酵母菌屬于釀酒酵母屬的種群Saccharomyces cerevisiae；王慧等［10］利用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析并結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)分析方法對(duì)陜甘寧和新疆及山東等地的葡萄果粒中的酵母菌菌株進(jìn)行了鑒定，最終共鑒定得到13個(gè)屬26個(gè)種群，其中最占優(yōu)勢(shì)的4個(gè)屬分別為Hanseniaspora、Candida、Pichia和Issatchenkia；郭冬琴等［11］利用形態(tài)學(xué)及26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析方法對(duì)腐敗橙汁中分離的酵母菌進(jìn)行了鑒定，最終確定得到的8株菌分別屬于4個(gè)已知的酵母菌種群。范佳等［12］對(duì)葡萄酒發(fā)酵液中的酵母進(jìn)行菌落形態(tài)、細(xì)胞顯微形態(tài)及26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析方法，最終鑒定得到5種分子類型的酵母菌，分別為膠紅酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa）、誕沫假絲酵母菌（Candida zeylanoides）、發(fā)酵畢赤酵母菌（Pichia fermentans）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和有孢圓酵母菌（Torulaspora delbrueckii）。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合傳統(tǒng)和現(xiàn)代分子生物學(xué)2種鑒定方法，最終對(duì)分離自河南輝縣太行山區(qū)域的野生葡萄表皮酵母菌進(jìn)行鑒定，為收集、鑒定和保藏野生優(yōu)質(zhì)酵母菌資源奠定了基礎(chǔ)，也為今后的研究提供了科學(xué)的參考和依據(jù)。

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中圖分類號(hào)：TS262.6；TS261.1；Q93-3；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）05-0057-04

基金項(xiàng)目：鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士科研基金資助（2014bsjj006）；國家自然科學(xué)基金青年基金資助（31400008）。

收稿日期：2016-01-15

作者簡(jiǎn)介：張俊杰（1984-），男，博士，鄭州輕工業(yè)學(xué)院特聘教授、碩士生導(dǎo)師，E-mail：kirka640@163.com。

DOI：10.13746/j.njkj.2016096

Isolation and Identification of Yeast Strains from Wild Grapes from Taihang Mountain in He'nan

ZHANG Junjie1，YANG Xu1，ZHANG Wenye1and LIU Chonghuai1
（1.School of Food & Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，He'nan 450002；2. Zhengzhou Fruit Tree Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，He'nan 450009，China）

Abstract：In order to obtain more quality wild yeast strains，six yeast strains（W1—W6）were isolated from the skin of wild grapes from Taihang Mountain in Henan by traditional microbial isolation method. Firstly，the six strains were primarily identified through morphology tests，then 26S rDNA D1/D2 sequences of the strains were analyzed and the phylogenetic tree was reconstructed for molecular identification. According to the morphology test，the six strains presented diversities in colony，microscopic and ascosporic morphologies，and growth characteristics in liquid medium，and they were primarily classified into five morphologic groups. 26S rDNA D1/D2 sequences analysis results indicated that the six yeast strains were distributed into four genus and five species：Hanseniaspora uvarum（W1），Metschnikowia pulcherrima（W2），Metschnikowia fructicola（W3），Debaryomyces hansenii（W4 and W6）and Pichia fermentans（W5）. And the analytic results were identical to morphological results.

Key words：microbe；wild grape；yeast；26S rDNAD1/D2；isolation and identification