魏玉潔，鄒　彎，王　威，張亞南，王德良，武　運(yùn)，薛　潔（.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊83005；.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京0005）

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新疆地產(chǎn)葡萄酒優(yōu)良釀酒酵母菌的篩選

魏玉潔1，鄒彎1，王威1，張亞南1，王德良2，武運(yùn)1，薛潔2
（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊830052；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

摘要：對(duì)新疆昌吉、瑪納斯和阜康3個(gè)主要釀酒地區(qū)的酵母菌進(jìn)行研究，以成熟期的赤霞珠、葡萄園中的土壤為原料，通過涂布、劃線的分離方法共分離純化出39株酵母菌，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定，確定39株酵母菌分別為Saccharomyces cerevisiae、Wickerhamomyces anomalus、Rhodotorula glutinis和Cyberlindnera fabianii。本研究對(duì)葡萄酒產(chǎn)區(qū)酵母種質(zhì)資源的探明具有重要意義。

關(guān)鍵詞：微生物；釀酒酵母；分離純化；鑒定

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-02-25；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1730.004.html。

自2013年以來，由于國(guó)內(nèi)葡萄酒企業(yè)間激烈的競(jìng)爭(zhēng)以及國(guó)外進(jìn)口葡萄酒的沖擊，對(duì)我國(guó)葡萄酒行業(yè)造成了嚴(yán)重的影響。進(jìn)口葡萄酒品種多樣，口味獨(dú)特且風(fēng)格各異，而我國(guó)葡萄酒風(fēng)味則大同小異，這使得國(guó)產(chǎn)葡萄酒在消費(fèi)者日漸追求高質(zhì)量產(chǎn)品的情況下處于被動(dòng)的局面［1-2］。

影響葡萄酒風(fēng)味的原因主要有3個(gè)，即釀酒原料（釀酒葡萄）、釀造工藝以及發(fā)酵過程中微生物的代謝，其中以微生物的代謝影響最為重要，菌種的差異決定了風(fēng)味物質(zhì)的含量與種類。由于釀酒葡萄的種植期一般為3～7年，從原料上改變同質(zhì)化現(xiàn)象需耗費(fèi)大量時(shí)間且成本較大；而采用具有典型性、個(gè)性化的釀酒微生物對(duì)葡萄酒的風(fēng)味進(jìn)行改善確是一種快速且有效的方法［3］，所以，選育有地方特色的葡萄酒優(yōu)良釀酒微生物對(duì)我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分深遠(yuǎn)的意義。新疆自古以來就是中國(guó)主要的釀酒葡萄及葡萄酒產(chǎn)地，具有得天獨(dú)厚的氣候、地理?xiàng)l件及資源優(yōu)勢(shì)。鑒于新疆地區(qū)的豐富資源，本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性及分子學(xué)鑒定法對(duì)新疆3個(gè)主要葡萄酒產(chǎn)地的酵母菌進(jìn)行鑒定，以期篩選出新疆地區(qū)葡萄酒中特有的優(yōu)良釀酒酵母菌，為新疆葡萄酒酵母菌的利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

樣品：實(shí)驗(yàn)所需的成熟期葡萄和土壤采集于新疆瑪納斯縣中信國(guó)安、阜康天山冰湖葡萄酒莊和昌吉遺韻酒莊，均位于新疆葡萄酒主要產(chǎn)區(qū)。

儀器：全溫振蕩器，生化培養(yǎng)箱，立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，pH計(jì)，熒光顯微鏡，生物安全操作臺(tái)，離心機(jī)，痕量分析型純水機(jī)，溫度梯度PCR儀，電泳儀，凝膠成像儀。

培養(yǎng)基：酵母菌分離純化培養(yǎng)基（麥芽汁培養(yǎng)基），酵母菌保藏培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基），WL培養(yǎng)基［4］，糖發(fā)酵培養(yǎng)基，液體無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基，液體無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，尿素培養(yǎng)基，明膠液化培養(yǎng)基，淀粉水解培養(yǎng)基，類淀粉化合物產(chǎn)生液體培養(yǎng)基。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酵母菌的分離純化

將葡萄從葡萄串上摘下來（葡萄上不帶果梗），約50粒放到含有2%的無菌葡萄糖水溶液中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以180 r/min在30℃下富集培養(yǎng)24 h。富集培養(yǎng)液按10倍梯度稀釋至10-7，取10-5、10-6、10-73個(gè)梯度的菌懸液各0.1 mL在麥芽汁培養(yǎng)基上涂布，28℃倒置培養(yǎng)48 h，選擇具有典型酵母菌菌落形態(tài)的單菌落進(jìn)行劃線純化，直至獲得純種菌株，最后將各菌株編號(hào)，并接種生長(zhǎng)于PDA培養(yǎng)基后在4℃冰箱中保藏備用［5-6］。

1.2.2酵母菌的鑒定

酵母菌的分類依據(jù)主要包括形態(tài)特征與生理學(xué)特征兩個(gè)方面，根據(jù)巴尼特鑒定手冊(cè)［7］，本研究關(guān)于酵母菌主要通過形態(tài)學(xué)觀察并結(jié)合一些生理生化實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行鑒定，最后采用分子生物學(xué)技術(shù)確定酵母菌的種類。

1.2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

（1）菌落形態(tài)

將待檢酵母菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，選取單菌落觀察其顏色、大小、形狀、光滑度、濕潤(rùn)度、透明度和邊緣是否整齊等特征。

將待檢酵母菌接種到WL培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2 d、5 d、8 d，選取單菌落觀察其顏色、大小和形狀等特征。

（2）細(xì)胞形態(tài)

在載玻片上滴加1滴呂氏美蘭染液，無菌操作，用接種環(huán)挑取少量酵母菌菌體置于染液中，混合均勻后蓋上蓋玻片，染色3 min后在40倍顯微鏡下觀察［8］。

1.2.2.2生理生化鑒定

（1）糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)［9］

酵母菌株先在無碳培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)3 d（防止假陽(yáng)性），然后將其接種于含有不同2%碳源的培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)2周，每天觀察杜氏管內(nèi)氣體產(chǎn)生情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

（2）碳源同化實(shí)驗(yàn)［10］

酵母在25℃下于液體無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)3 d，制備碳源饑餓酵母。然后在液體無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加不同的碳源作為唯一碳源，接種碳源饑餓酵母后28℃培養(yǎng)1周，觀察酵母是否生長(zhǎng)，試管中出現(xiàn)渾濁為陽(yáng)性，記作“+”；試管澄清為陰性，記作“-”，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

（3）氮源同化實(shí)驗(yàn)

酵母在25℃下用液體無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)5 d，制備氮源饑餓酵母。然后在液體無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加硝酸鉀作為唯一氮源，接種氮源饑餓酵母后28℃培養(yǎng)數(shù)天，觀察酵母是否生長(zhǎng)，試管中出現(xiàn)渾濁為陽(yáng)性，記作“+”；試管澄清為陰性，記作“-”，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

（4）尿素分解實(shí)驗(yàn)［11］

在尿素培養(yǎng)基上接種待測(cè)菌株，于28℃下培養(yǎng)5～7 d，菌體呈淡紅色，表明待測(cè)菌株能分解尿素，為陽(yáng)性，記為“+”；反之為陰性，記為“-”。

（5）明膠液化實(shí)驗(yàn)

在無菌操作臺(tái)中進(jìn)行酵母菌穿刺接種，深度約2/3。于28℃下培養(yǎng)1周，每天觀察明膠是否有液化現(xiàn)象產(chǎn)生。若明膠液化，則是陽(yáng)性，記為“+”；反之是陰性，記為“-”，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

（6）淀粉水解實(shí)驗(yàn)

將菌種點(diǎn)接在培養(yǎng)基上，每個(gè)平皿可同時(shí)點(diǎn)接4種不同的菌，將接種好的培養(yǎng)皿置于28℃下培養(yǎng)24 h，然后滴加少量碘液于平皿上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平皿。若菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已經(jīng)被水解，該菌種有分解淀粉的能力，反之則沒有。同時(shí)，可以通過透明圈的大小反映出待測(cè)菌種水解淀粉能力的強(qiáng)弱。

（7）產(chǎn)類淀粉化合物實(shí)驗(yàn)

將酵母接種于PDY培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)后加入2滴盧哥氏碘液，呈藍(lán)色則為陽(yáng)性，表示生成了類淀粉化合物。

1.2.3分子生物學(xué)鑒定

1.2.3.1酵母菌DNA的提取

將待測(cè)菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)24 h，取2 mL菌液于滅菌的離心管中，12000 r/min離心1 min，棄上清液，再加入無菌水與待測(cè)菌混勻，12000 r/min離心1 min，棄上清液，重復(fù)此步驟3次，得到菌體沉淀，按照酵母菌試劑盒說明書提取酵母菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增［12］

酵母菌26S rDNAD1/D2區(qū)域特異性片段擴(kuò)增引物為：

NL1（5′GCATATCAATAAGCGGAGGAAAG3′）；NL4（5′GGTCCGTGTTTCAAGACGG3′）。

PCR（50 μL）反應(yīng)體系：dNTP 4 μL，10×Buffer 5 μL，NL1和NL4各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶0.25 μL，ddH2O 37.75 μL，充分混勻。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，52℃退火45 s，72℃延伸40 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，-20℃保存。

PCR完成后，取PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳上電泳，100 V恒壓電泳。最后用凝膠成像儀觀察結(jié)果，并將有結(jié)果的PCR產(chǎn)物送至北京奧維森基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.3.3序列對(duì)比

將所測(cè)的酵母菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行對(duì)比，選取基因序列同源性較高的相關(guān)酵母菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列作為參比對(duì)象，用MEGA6.0進(jìn)行相似性分析，確定菌種。

2結(jié)果與分析

2.1酵母菌分離純化結(jié)果

通過分離純化，確定酵母菌有39株，見表1。

表1　葡萄、土壤中微生物的分布

由表1可以看出，從瑪納斯的葡萄表面和土壤中分別分離出了6株和7株酵母菌，從阜康的葡萄表面分離出了9株酵母菌，土壤中未分離，從昌吉的葡萄表面和土壤中分別分離出了15株和2株酵母菌。這些數(shù)據(jù)顯示，釀酒葡萄表皮分離出的酵母菌明顯多于土壤中的酵母菌，這主要由于新疆地區(qū)氣候干旱，土壤保水性比較差，不利于微生物的繁殖，造成土壤中的微生物非常少，同時(shí)由于氣候干燥，葡萄果皮中的微生物也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于從昌黎、沙城等釀酒產(chǎn)區(qū)分離的微生物數(shù)量［13］，而且即使都是新疆產(chǎn)區(qū)，由于小區(qū)域氣候的差異，造成瑪納斯、昌吉地區(qū)分離的酵母菌多于阜康地區(qū)。

2.2菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)鑒定結(jié)果

2.2.1菌落形態(tài)結(jié)果

39株酵母菌在麥汁培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)，見表2。

由表2看出，從麥汁培養(yǎng)基上分離出的酵母菌大多數(shù)呈乳白色，少有白色，還有1株呈紅色，直徑在0.3～0.7 cm之間，菌體有凸起的，也有平坦的，并且菌體不透明，其表面濕潤(rùn)光滑，少有黏稠。就此來看，基本符合《酵母菌鑒定手冊(cè)》中所描述的酵母菌的菌落形態(tài)，可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2細(xì)胞形態(tài)結(jié)果

將39株酵母菌在顯微鏡下觀察，結(jié)果見表3。

表3　酵母菌細(xì)胞形態(tài)

將酵母菌接種于WL培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2 d、5 d、8 d后觀察，與參考文獻(xiàn)中對(duì)生長(zhǎng)于WL培養(yǎng)基上的酵母菌顏色、形態(tài)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表4。

參照參考文獻(xiàn)中對(duì)生長(zhǎng)于WL培養(yǎng)基上酵母菌的菌落形態(tài)描述［14］，觀察本研究所分離純化出的酵母菌，可初步將此39株酵母菌判斷為6個(gè)種類：Saccharomyces cerevisiae、Rhodotorula glutinis、Hanseniaspora uvarum、Wickerhamomyces anomalus、Zygosaccharomyces bailli及Cyberlindnera fabianii。

2.3酵母菌生理生化鑒定結(jié)果

從表4初步判定的6種酵母菌中選出10株具有代表性的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見表5—表7。

根據(jù)資料報(bào)道，Saccharomyces cerevisiae可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖等，同化半乳糖、麥芽糖等碳源和硝酸鉀；Wickerhamomyces anomalus對(duì)葡萄糖和蔗糖有弱發(fā)酵，可以同化麥芽糖、棉籽糖等碳源和L-賴氨酸；Cyberlindnera fabianii對(duì)半乳糖發(fā)酵有可變性，對(duì)同化半乳糖、淀粉、L-阿拉伯糖有可變性，可同化L-賴氨酸；Rhodotorula glutinis不發(fā)酵上述糖類，可以同化棉籽糖、琥珀酸等碳源和同化硝酸鉀、L-賴氨酸［15-16］。因此，根據(jù)表5—表7結(jié)果，結(jié)合WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，本實(shí)驗(yàn)中39株酵母菌屬于4個(gè)種類，即Saccharomyces cerevisiae、Cyberlindnera fabianii、Wickerhamomyces anomalus和Rhodotorula glutinis。

表2　麥汁培養(yǎng)基上酵母菌菌落形態(tài)

表4　39株酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)描述

表5　酵母菌糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

表7　酵母菌明膠液化、淀粉水解、尿素水解、產(chǎn)類淀粉化合物實(shí)驗(yàn)

2.4酵母菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.4.1 26S rDNA區(qū)域擴(kuò)增后電泳結(jié)果

根據(jù)1.2.3.2中PCR體系及條件，以酵母DNA為模版，擴(kuò)增特異性序列，用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見圖1—圖3?？梢钥闯?，酵母的特異性片段長(zhǎng)度約為600 bp，擴(kuò)增結(jié)果基本符合實(shí)際要求，可將其送交至測(cè)序公司測(cè)序。

2.4.2酵母菌菌種確定

將測(cè)序后的酵母菌與國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI中已確定的核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定為Saccharomyces cerevisiae、Wickerhamomyces anomalus、Rhodotorula glutinis和Cyberlindnera fabianii，結(jié)果見表8。

由測(cè)序結(jié)果可以看出，39株酵母菌中多數(shù)為釀酒酵母，后期將繼續(xù)進(jìn)行酵母菌耐受性實(shí)驗(yàn)，從而篩選出適合于新疆葡萄酒的優(yōu)良釀酒酵母菌；同時(shí)，可以研究4株非釀酒酵母的特性，以期運(yùn)用于葡萄酒的釀造。

3討論與展望

通過平板涂布和劃線，從葡萄表面和土壤中共分離純化出39株酵母菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)及26S rDNA基因序列鑒定，鑒定結(jié)果為35株Saccharomyces cerevisiae，1株Cyberlindnera fabianii（Y9），2株Wickerhamo-myces anomalus（Y10、Y11）和1株Rhodotorula glutinis （Y31），其中Saccharomyces cerevisiae占89.74%，為優(yōu)勢(shì)菌，Wickerhamomyces anomalus占5.12%，Cyberlindnera fabianii和Rhodotorula glutinis各占2.57%。

表6　　酵母菌碳源同化、氮源同化實(shí)驗(yàn)

注：“+”表示試管中出現(xiàn)渾濁，可以同化此糖；“-”表示試管中未出現(xiàn)渾濁，不可以同化此糖；“V”表示具有可變性。

圖1　　 Y1—Y10 26S rDNA區(qū)域擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2　　 Y11—Y32 26S rDNA區(qū)域擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3　 Y33—Y39 26S rDNA區(qū)域擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖

表8　酵母菌測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果

從酵母菌的總體分布來看，3個(gè)地區(qū)的土壤中所分離的酵母菌較少，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該產(chǎn)區(qū)土壤為沙壤土，整體略偏堿性，土壤中有機(jī)質(zhì)含量較低，其中全氮、有效氮含量處于低及以下水平，有效磷處于高水平，有效鉀含量正常，而有效鐵和錳在不同程度上存在缺乏狀況，這就使得微生物生長(zhǎng)所需的物質(zhì)比例失去了平衡，氮源不足更是嚴(yán)重影響酵母菌的生長(zhǎng)，同時(shí)酵母菌的最適pH值為4.5～5.0，堿性的土壤也使酵母菌數(shù)量有所減少。

將3個(gè)地區(qū)所分離的酵母菌進(jìn)行對(duì)比，昌吉、瑪納斯地區(qū)稍比阜康地區(qū)的要多，很多研究表明，一個(gè)葡萄園中的酵母菌數(shù)量和種類與葡萄種植的時(shí)間（即葡萄樹樹齡）和管理有著密不可分的關(guān)系。瑪納斯、昌吉地區(qū)種植釀酒葡萄時(shí)間較長(zhǎng)，從1995年開始就逐漸引進(jìn)赤霞珠并嚴(yán)格管理葡萄園，以確保葡萄的健康生長(zhǎng)，而阜康的種植時(shí)間與之相比晚了約10年，因此，從酵母菌的數(shù)量上來說，阜康地區(qū)略顯遜色。本研究分離出的非釀酒酵母Wickerhamomyces anomalus和Rhodotorula glutinis來自昌吉地區(qū)的遺韻酒莊，Cyberlindnera fabianii來自阜康地區(qū)的天山冰湖葡萄酒莊。目前，國(guó)內(nèi)外很多葡萄酒研究者已著手于非釀酒酵母在葡萄酒中的應(yīng)用研究，其特異性的代謝活動(dòng)，對(duì)葡萄酒的品質(zhì)和風(fēng)味尤其是香氣具有非常大的影響［17-19］。例如Ciani研究表明，非釀酒酵母可以通過其數(shù)量及在發(fā)酵過程中存在的時(shí)間對(duì)葡萄酒產(chǎn)生影響，如果能夠適當(dāng)?shù)目刂破浔壤按嬖跁r(shí)間，可有效提高葡萄酒風(fēng)味的復(fù)雜性［20］。與瑪納斯的葡萄酒廠相比，遺韻酒莊和天山冰湖酒莊更注重葡萄酒的質(zhì)量而不是產(chǎn)量，所以其葡萄園的管理?xiàng)l件更為嚴(yán)格，對(duì)土壤、水源等的要求都較高，這便給酵母菌創(chuàng)造了一個(gè)良好的生長(zhǎng)環(huán)境，其種類自然會(huì)更豐富。

通過目前所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)看出，這3個(gè)地區(qū)的土質(zhì)還需要進(jìn)一步進(jìn)行合理的調(diào)節(jié)和改善，后期實(shí)驗(yàn)將對(duì)已經(jīng)分離出的釀酒酵母菌進(jìn)行耐受性實(shí)驗(yàn)，篩選出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)、起酵速度快、酒精耐受性好、耐SO2能力強(qiáng)、耐酸性好的釀酒酵母菌，同時(shí)研究4株非釀酒酵母的特性，期望通過非釀酒酵母對(duì)葡萄酒的風(fēng)味進(jìn)行改善，提高葡萄酒的品質(zhì)。

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中圖分類號(hào)：TS261.1；Q93-3；TS262.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）05-0042-06

基金項(xiàng)目：新疆自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（201431113）。

收稿日期：2015-11-19

作者簡(jiǎn)介：魏玉潔（1991-），女，在讀碩士研究生。

Screening of High-Quality Yeast Strains in Xinjiang Wine-Producing Regions

WEI Yujie1，ZOU Wan1，WANG Wei1，ZHANG Yanan1，WANG Deliang1，WU Yun1and XUE Jie2
（1. Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052；2.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：Yeast strains in three major wine-producing regions in Xinjiang including Changji，Manasi and Fukang were selected as the research objects. Then 39 yeast strains were separated and purified through coating method and plate streak method with mature Cabernet Sauvignon and soil from the vineyards as raw materials. Through traditional morphology observation，physiological and biochemical experiment and molecular biological identification，those strains were identified as Saccharomyces cerevisiae，Wickerhamomyces anomalus，Rhodotorula glutinis and Cyberlindnera fabianii. This research was of important significance in the exploration of yeast strain resources in Xinjiang wine-producing regions.

Key words：microbe；S. cerevisiae；separate and purification；identification