孫小花，陳海嘯

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·論著·

卵子玻璃化冷凍復(fù)蘇后行卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子顯微注射27例臨床結(jié)局

孫小花，陳海嘯

目的探討卵子玻璃化冷凍技術(shù)在輔助生殖中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法回顧性分析2013年1月-2015年12月在解放軍174醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精，取卵日因男方因素未取到精子而行卵子玻璃化冷凍保存的27對不孕夫婦的資料。卵子解凍后均行夫精卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子顯微注射，記錄卵子受精情況及臨床結(jié)局。結(jié)果27例患者共冷凍卵子245枚，并全部解凍，解凍后存活214枚，存活率84.79%；其中第二次減數(shù)分裂中期(metaphase Ⅱ,MⅡ)卵 198枚，并全部行ICSI，受精138枚，受精率74.49%；卵裂99枚，卵裂率71.74%；形成87枚2PN(原核，pronucleus)胚胎，優(yōu)質(zhì)胚胎34枚，優(yōu)質(zhì)胚胎率39.08%。20個(gè)移植周期移植胚胎41枚，臨床妊娠6例，臨床妊娠率34.82%。結(jié)論玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用于卵子冷凍保存，并對復(fù)蘇卵子進(jìn)行卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子顯微注射可以取得一定的臨床妊娠率，在輔助生殖技術(shù)臨床上具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

玻璃化冷凍；卵子；卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射；臨床結(jié)局

輔助生殖技術(shù)是20世紀(jì)醫(yī)學(xué)的一大進(jìn)展。在中國輔助生殖技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入相對成熟階段，體外受精胚胎移植及其衍生技術(shù)等在中國已經(jīng)非常成熟。但由于受到技術(shù)、倫理、法律、道德、宗教等多方面問題影響，卵子冷凍在中國發(fā)展曲折且緩慢。目前玻璃化冷凍技術(shù)及卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)很大程度上解決了卵子冷凍的技術(shù)困難，大大提高了冷凍卵子的復(fù)蘇存活率及受精率。胚胎玻璃化冷凍技術(shù)已經(jīng)很成熟，而卵子的玻璃化冷凍還在摸索階段。本文回顧性分析2013年1月-2015年12月在廈門解放軍174醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心因男方原因未獲得可用精子而接受卵子玻璃化冷凍的27例患者的妊娠結(jié)局，探討在體外受精-胚胎移植中，面對未預(yù)期的取精失敗行卵子玻璃化冷凍的臨床可行性。

1　對象與方法

1.1對象 2013年1月-2015年12月來廈門解放軍174醫(yī)院生殖中心實(shí)施體外受精-胚胎移植的27位不孕女性患者，取卵日因男方取精困難未取到精、無精子癥行睪丸或附睪穿刺取精失敗、男方無法到場等原因未獲得可用精子，無法行體外受精，將其卵子全部進(jìn)行玻璃化冷凍。凍卵者平均年齡31.18歲，平均不孕年限4.82年。冷凍卵子解凍后均進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射治療。

1.2卵子玻璃化冷凍及解凍方法本中心采用玻璃化冷凍技術(shù)對卵子進(jìn)行冷凍保存，卵子冷凍在獲卵后2～4 h內(nèi)進(jìn)行，不得超過8 h。先在室溫下準(zhǔn)備平衡液(equilibration solution, ES)及冷凍液(vitrification solution, VS)。冷凍時(shí)將卵子置于平衡液中5 min后轉(zhuǎn)入冷凍液中，在冷凍液中將卵子反復(fù)吸放，使卵子盡快下沉，用時(shí)不超過60 s。然后迅速將卵子轉(zhuǎn)移的玻璃化冷凍載體并浸入液氮冷凍。卵子復(fù)蘇液由中心實(shí)驗(yàn)室配置，根據(jù)蔗糖濃度高低，將復(fù)蘇液(warming solution, WS)分為WS1(高糖)、WS2(中糖)、 WS3(低糖)、WS4(無糖)。5個(gè)培養(yǎng)皿第1個(gè)裝1 mL WS1在溫度37 ℃下平衡30 min，另4個(gè)分別裝1 mL WS2、1 mL WS3、0.5 mL WS4、0.5 mL S4均在室溫(20～25 ℃)下平衡30 min。將裝有卵子的玻璃化冷凍載體從液氮中取出，迅速將卵子置入WS1中，1 min后將卵子轉(zhuǎn)移入WS2內(nèi)，放置3 min，再依次將卵子轉(zhuǎn)移入WS3、WS4、WS4，分別放置3 min，卵子形態(tài)完全恢復(fù)后，將卵子轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

2　結(jié)　果

27例患者共冷凍卵子245枚，全部接受卵子解凍。共解凍卵子245枚，存活214枚，復(fù)蘇存活率84.79%。其中MⅡ卵 198枚，并全部行ICSI,受精138枚，受精率74.49%。卵裂99枚，卵裂率為71.74%，形成87枚2PN胚胎，優(yōu)質(zhì)胚胎34枚，優(yōu)胚率39.08%。27例患者共移植胚胎41枚，平均移植胚胎數(shù)2.11個(gè)。20個(gè)移植周期中臨床妊娠6例，臨床妊娠率為34.82%。剩余10枚胚胎冷凍保存(表1)。

27例患者按年齡分為4組，患者年齡26～35歲，各年齡段患者卵子玻璃化冷凍復(fù)蘇后行ICS妊娠率見表1。

表1　27例患者卵子玻璃化冷凍復(fù)蘇后行ICSI-ET數(shù)據(jù)表

3　討　論

自1986 年首例卵子冷凍-復(fù)蘇并成功受孕后, 冷凍卵子成為保存婦女生育能力的有效儲備方式之一。并且越來越多的學(xué)者推薦卵子冷凍做為輔助生殖技術(shù)重要的組成部分。 因慢速冷凍法無法避免細(xì)胞冰晶形成造成的損傷, 特別是對于卵子這種體表比例大的細(xì)胞。近年來，卵子玻璃化冷凍在臨床上的應(yīng)用不斷擴(kuò)大。玻璃化冷凍技術(shù)是超快冷凍技術(shù)，可導(dǎo)致溶液(如胚胎內(nèi)外的溶液)的固化，低溫最終可使溶液形成玻璃樣固態(tài)物質(zhì)。玻璃化過程使高濃度冷凍保護(hù)劑，保證獲得超快冷凍，因此不會有冰晶形成，通過使細(xì)胞脫水更加充分, 解決了卵子冷凍冰晶損害的問題[5-7]，是目前卵子冷凍的首選方法。本研究將行卵子玻璃化冷凍復(fù)蘇并行ICSI的患者按照年齡分為4組，發(fā)現(xiàn)不同年齡階段患者妊娠率不同。本中心卵子凍融后總的臨床妊娠率超過30%，接近冷凍胚胎復(fù)蘇移植妊娠率。因?yàn)闃颖玖枯^小，其臨床可行性仍有待大樣本量數(shù)據(jù)證實(shí)。但其在取卵日因男方原因無法獲得可用精子的情況下進(jìn)行卵子冷凍的臨床可行性已經(jīng)明確，并且十分有效。從程序化慢速冷凍到玻璃化冷凍，卵子冷凍方法不斷改進(jìn)和完善。冷凍技術(shù)的進(jìn)展使得卵子冷凍后的復(fù)蘇率、妊娠率以及出生率均明顯提高。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道, 冷凍和新鮮卵子在胎兒及圍產(chǎn)期并發(fā)癥和先天異常的發(fā)生率上并沒有顯著差異。然而, 目前卵子玻璃化冷凍復(fù)蘇仍存在一定的臨床局限性，如卵子玻璃化冷凍可對卵子造成一定程度的損傷，主要表現(xiàn)為染色體、紡錘體、透明帶等損傷。目前醫(yī)學(xué)上仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)的玻璃化冷凍方案，復(fù)蘇速率、冷凍保護(hù)劑濃度、溫度控制等各種因素均會影響卵子冷凍復(fù)蘇成功率[10]；冷凍導(dǎo)致卵子透明帶硬化,精子穿透透明帶能力下降, 卵子冷凍復(fù)蘇后行IVF受精率低[11]，異常受精率增加，ICSI雖然能在一定程度上提高受精率，降低異常受精率，但無法避免ICSI本身存在的風(fēng)險(xiǎn)。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，卵子玻璃化冷凍不僅僅應(yīng)用于男方因素?zé)o法行IVF的卵子保存，還可應(yīng)用于為年輕未育患者保存生育力，為無卵、卵巢功能早衰患者提供卵子[12]。凍存人類卵母細(xì)胞是一項(xiàng)極具價(jià)值和吸引力的技術(shù)，在輔助生殖領(lǐng)域上有相當(dāng)廣闊的發(fā)展前景。

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(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

Clinical outcome of 27 intracytoplasmic sperm injection cycles with total oocytes cryopreserved using vitrification

SUN Xiao-hua, CHEN Hai-xiao.

ReproductiveMedicineCenter, 174HospitalofPLA,Xiamen,Fujian361000,China

Objective To investigate the clinical application value of vitrification cryopreservation of egg in human assistant reproduction. MethodsA retrospective study was performed on patients underwent IVF/ICSI treatment in the reproductive medicine center in 174 hospital of PLA from 2013 to 2015. 27 couples with infertility without sperm for fertilization or insemination were included. All oocytes were cryopreserved using vitrificaiton and carried ICSI after oocyte were thawed. Basic characteristics, oocytes fertilization and clinical outcomes were analyzed. ResultsTotally 245 oocytes were cryopreserved using vitrification, and 214 oocytes survived. The survival rate was 84.79%; 198 mature oocytes performed ICSI treatment, and 138 oocytes fertilized. The fertilization rate was 74.49%; 99 embryo cleaved after ICSI, and the cleavage rate was 71.74%; 87 2PN embryos formed, and 34 embryos were high-quality embryos. The high-quality embryo rate was 39.08%. 20 cycles performed fresh embryo transfer, and 6 embryos got clinical pregnancy. The clinical pregnancy rate was 34.82%. ConclusionA certain clinical pregnancy rate can be achieved in ICSI cycles with total oocytes cryopreserved using vitrificaiton, and oocyte vitrification is practically useful in human assistant reproduction.

vitrificaiton; oocyte; intracytopasmic injection; clinical outcome

361000福建廈門，解放軍174醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心

引用格式：孫小花，陳海嘯.卵子玻璃化冷凍復(fù)蘇后行卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子顯微注射27例臨床結(jié)局.東南國防醫(yī)藥，2016,18(3):262-264.

R713.7

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.03.012

2016-03-04；

2016-03-16)