許　珂，王興玲，劉艷麗

(1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 生殖中心，河南 鄭州 450052；2.河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

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大鼠卵巢組織兩個(gè)自體移植部位移植效果的比較

許珂1,2，王興玲1，劉艷麗1

(1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 生殖中心，河南 鄭州 450052；2.河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

[摘要]目的探討去勢(shì)SD大鼠自體卵巢組織兩種不同移植方法的效果比較。 方法按照移植部位不同將SD大鼠隨機(jī)分為腎被膜下移植組、頸部皮下移植組和對(duì)照組，每組20只。記錄各組手術(shù)所用時(shí)間、移植后大鼠動(dòng)情周期變化，并給予HMG促排卵48 h后回收卵巢組織進(jìn)行HE染色觀察組織學(xué)變化和計(jì)算卵子存活率。結(jié)果腎被膜下組較頸部皮下組所用手術(shù)時(shí)間短，分別為(18.8±2.5) min和(20.7±2.8)min，P<0.05；腎被膜下組與頸部皮下組移植后大鼠動(dòng)情周期出現(xiàn)率分別為81.25%與61.11%，差異有顯著性意義(P<0.05)，大鼠恢復(fù)動(dòng)情周期天數(shù)無(wú)差異。兩組促排后大鼠移植部位卵巢組織回收率分別為：腎被膜下組81.3%，頸部皮下組55.6%，差異有顯著性意義(P<0.05)。但兩移植組回收卵巢組織卵泡存活數(shù)較對(duì)照組減少(均P<0.05)，兩移植組間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。結(jié)論與頸部皮下移植相比，大鼠卵巢組織自體腎被膜移植可獲得更好的效果。

[關(guān)鍵詞]卵巢組織；自體異位移植；去勢(shì)；SD大鼠；動(dòng)情周期

[引用本文]許珂,王興玲，劉艷麗.大鼠卵巢組織兩個(gè)自體移植部位移植效果的比較[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,38(1)：24-27.

近年來，青春期和育齡期婦女惡性腫瘤病人逐年增加，但隨著癌癥診斷和治療技術(shù)的進(jìn)步，死亡率顯著下降，生存期限大大延長(zhǎng)。然而女性的卵巢對(duì)放化療非常敏感，其生殖內(nèi)分泌功能會(huì)受到輻射或藥物毒性損傷。許多病人在接受放化療以及婦科根治性手術(shù)后，出現(xiàn)卵巢功能衰竭。卵巢早衰(POF)會(huì)造成月經(jīng)稀發(fā)、不孕、閉經(jīng)，及因雌激素缺乏而造成心血管系統(tǒng)疾病和骨質(zhì)疏松等[1]，嚴(yán)重影響女性患者的生活質(zhì)量。病人愈后能否獲得生育能力，是關(guān)系其生活質(zhì)量的重要問題。這就使得卵巢內(nèi)分泌功能和生育能力的保存越來越受到重視。

目前，國(guó)內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)研究和初步臨床應(yīng)用已經(jīng)證實(shí)通過自體移植卵巢有可能恢復(fù)患者的生育能力和內(nèi)分泌功能[2]。然而，卵巢組織移植過程許多基礎(chǔ)理論研究仍然處于初步階段，移植后缺血再灌注損傷仍然是阻礙移植卵巢功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素。有研究發(fā)現(xiàn)將卵巢組織移植到傷口愈合過程中形成的肉芽組織內(nèi)，能減少組織的缺血損傷時(shí)間[3]。本實(shí)驗(yàn)將SD雌性大鼠新鮮卵巢組織分別自體移植到一側(cè)腎被膜下和頸部皮下預(yù)制的肌層創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)，探討大鼠兩種不同移植部位的移植效果，以期為人類卵巢組織移植的開展應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雌性大鼠60只，6周齡，體重25～35 g，購(gòu)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(豫)2010-002。飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，人工控溫20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，給予營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水，1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。40只先做去勢(shì)手術(shù)之后再進(jìn)行移植(腎被膜下移植組和頸部皮下移植組各20只)，另20只作為對(duì)照組不作任何處理。

1.2大鼠去勢(shì)手術(shù)

采用背式卵巢去勢(shì)：按0.1 mL/10 g 劑量腹腔注射0.5%的水合氯醛麻醉大鼠。將大鼠固定，碘伏常規(guī)消毒。在肋脊角水平，沿正中腰部切開一小口(2 mm)。沿肌肉走向切開肌肉進(jìn)入后腹膜，循子宮分支找出卵巢，從輸卵管處結(jié)扎卵巢動(dòng)靜脈，并切除卵巢。同法切除對(duì)側(cè)卵巢。將切除的卵巢剪成碎片，置于0.9%生理鹽水中待用。

1.3兩種自體卵巢組織移植方法

1.3.1腎被膜下移植：沿子宮向腹腔深處找到腎臟，從腎上極用顯微鑷將切開的大鼠卵巢組織片塞入提起的一側(cè)腎被膜下并將其推至腎臟下極，由于腎臟被膜有一定張力，組織放入后不需縫合，把腎臟送入腹腔原位后，依次縫合手術(shù)切口。

1.3.2頸部皮下移植：移植前2天將大鼠麻醉后用碘伏常規(guī)消毒頸背部皮膚，手術(shù)剪剪開約2 mm小口，肌層內(nèi)用小彎鉗鈍性分離一創(chuàng)面，然后縫合切口。移植日將大鼠卵巢組織片置于頸部皮下預(yù)制的肌層創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)，縫線固定，縫合。

兩移植組術(shù)后均給予青霉素4 IU/只腹腔注射，1次/d，共3 d。

1.4促排卵

移植2周后肌注人絨毛膜促性腺激素(HMG)10 IU/只，注射1次。對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)，2周后肌注HMG 10 IU/只。

1.5觀察指標(biāo)

記錄手術(shù)時(shí)間及手術(shù)結(jié)束后大鼠生存情況。術(shù)后1周，所有大鼠每日8：00行陰道脫落細(xì)胞涂片，室溫干燥，于95%酒精中固定10～15 min，經(jīng)巴氏染色后顯微鏡下觀察動(dòng)情周期。促排卵48 h將大鼠脫臼處死回收卵巢移植體，計(jì)算卵巢組織移植塊回收率。將移植的卵巢組織進(jìn)行HE染色，觀察其組織學(xué)變化，卵泡存活數(shù)/HPF。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩移植組大鼠手術(shù)時(shí)間及術(shù)后情況比較

腎被膜下組手術(shù)所用時(shí)間為(18.8±2.5)min， 頸部皮下組手術(shù)所用時(shí)間為(20.7±2.8)min，兩組差異有顯著性意義(P=0.026)。移植術(shù)后，腎被膜下組有4只大鼠死亡，頸部皮下組有2只大鼠死亡，對(duì)照組無(wú)大鼠死亡。

2.2各組大鼠動(dòng)情周期情況比較

未去勢(shì)對(duì)照組大鼠全部有規(guī)律的動(dòng)情周期；腎被膜下移植組16只大鼠中13只出現(xiàn)動(dòng)情周期，頸部皮下移植組18只中11只出現(xiàn)動(dòng)情周期，動(dòng)情周期出現(xiàn)率分別為81.25%與61.11%，差異有顯著性意義(P<0.05)，但兩組動(dòng)情周期天數(shù)無(wú)差異。

2.3各組卵巢組織回收情況比較

術(shù)后存活大鼠移植部位卵巢組織回收，腎被膜下移植組回收率81.3%，頸部皮下移植組回收率55.6%，兩組比較差異有顯著性意義，P<0.05。

2.4各組移植后卵巢組織學(xué)檢查及卵泡存活情況比較

回收卵巢移植體，可見移植體均生長(zhǎng)增大，呈圓形或腎形凸起(圖1)，表面見大量血管形成。移植組卵巢組織切片中卵泡形態(tài)與新鮮卵巢相近，結(jié)構(gòu)正常，卵母細(xì)胞保持圓形，透明帶完整，周圍顆粒細(xì)胞形態(tài)正常(圖2)。每高倍視野卵泡數(shù)比較，對(duì)照組較腎被膜下移植組和頸部皮下移植組卵泡數(shù)目更多(P=0.001)。而腎被膜下移植組和頸部皮下移植組間相比差異無(wú)顯著性意義(P=0.092)，見表1。

腎被膜移植組，恢復(fù)動(dòng)情周期的13只大鼠中有24只卵巢出現(xiàn)不同發(fā)育階段的卵泡和排卵后出現(xiàn)的黃體；頸部皮下移植組，恢復(fù)動(dòng)情周期的11只大鼠中有18只卵巢出現(xiàn)不同發(fā)育階段的卵泡和排卵后出現(xiàn)的黃體；其余的卵巢和未恢復(fù)動(dòng)情周期的大鼠均未見卵泡的發(fā)育，可見卵巢組織有壞死后增生或炎癥浸潤(rùn)。

表1　3組大鼠存活卵泡計(jì)數(shù)

1)與對(duì)照組相比，P<0.05

圖1　腎被膜下的卵巢移植體Fig 1 Ovary graft under the kidney capsulea:圓形；b:腎形

圖2　新鮮卵巢與移植卵巢組織切片形態(tài)Fig 2 Sections tissue morphology of fresh ovarian and transplanted folliclesa:新鮮卵巢組織切片；b:移植卵巢組織切片。所示卵母細(xì)胞圓形；所示透明帶完整；周圍顆粒細(xì)胞形態(tài)正常

3討論

隨著卵巢移植技術(shù)和輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，卵巢及其生殖細(xì)胞作為極珍貴的生殖資源備受人們的關(guān)注，卵巢組織冷凍及移植是目前最寄予期望的一項(xiàng)技術(shù)[4]。為了能夠更好的利用和保存卵巢生殖細(xì)胞，卵巢移植技術(shù)不斷得到完善，將成為延續(xù)和保存雌性生殖能力的一種有效方法[56]。1896年Knauer首次將自體卵巢移植在動(dòng)物身上并獲得成功[7]，1906年Carrel應(yīng)用血管吻合方法進(jìn)行卵巢移植，使移植的卵巢存活并成功創(chuàng)立了器官移植血管吻合技術(shù)[8]。隨后相繼成功在大鼠、兔、羊、豬、獼猴和人等都進(jìn)行了卵巢移植。近年來卵巢移植技術(shù)更是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到深入廣泛的研究，并顯示出良好的應(yīng)用前景。

國(guó)內(nèi)外卵巢移植的臨床效果不盡令人滿意，許多基本理論問題沒有得到有效的闡明[9]，很多基礎(chǔ)研究有待于進(jìn)一步開展。本研究采用大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是因其繁殖周期短、價(jià)格便宜且動(dòng)情周期較短等，可進(jìn)行大樣本的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于移植部位的選擇上，為了提高移植后卵巢組織的存活率，人們常選擇血供豐富的部位，如肝被膜下、腎被膜下和頸部皮下等，但是不同移植部位的結(jié)果并未顯示卵巢組織存活率、卵泡發(fā)育和血清激素水平有明顯的差別[10]。研究中人們發(fā)現(xiàn)宿主去勢(shì)后可以提高卵巢組織的移植效果，這可能是由于卵泡生長(zhǎng)與卵泡刺激素(FSH)關(guān)系非常密切所致[11]。有研究也證明促性腺激素是可以促進(jìn)卵巢組織移植后血管生成與卵泡存活的[12]。把大鼠先去勢(shì)再移植，其目的主要是取消大鼠性腺功能對(duì)其中樞的負(fù)反饋?zhàn)饔?，使FSH分泌增加，進(jìn)而改善移植效果。2012 年 Hayashi 等[13]研究發(fā)現(xiàn)雌性去勢(shì)大鼠通過結(jié)合高壓氧治療可以明顯改善自體卵巢組織異位移植的效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠去勢(shì)后自體移植腎被膜下較頸部皮下優(yōu)點(diǎn)多。(1)腎被膜下移植的最重要優(yōu)點(diǎn)是血供豐富，移植物易于成活。(2)腎被膜下移植比頸部皮下移植手術(shù)時(shí)間短，因進(jìn)行頸部皮下移植時(shí)除了背部去勢(shì)手術(shù)切口外，還需要在頸部另外剪開一個(gè)切口，移植后另行縫合增加了手術(shù)時(shí)間。(3)腎被膜下移植卵巢回收率明顯高于頸部皮下移植組?？赡苡捎谝浦灿谀I被膜下有包膜包裹，卵巢組織不容易游走；而移植于頸部皮下，雖然縫合于預(yù)制的肉芽組織中，還是容易游走，很難回收。(4)頸部皮下移植較腎被膜下移植多了手術(shù)切口，增加了術(shù)后感染風(fēng)險(xiǎn)。因此本研究認(rèn)為腎被膜下較頸部皮下更適合作為動(dòng)物模型中卵巢移植的部位。早在2000年就有研究認(rèn)為腎被膜移植優(yōu)于頸部皮下移植[14]，本研究也印證了此結(jié)論。

同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)腎被膜下移植出血較多，操作難度較大，這就要求術(shù)者掌握熟練的手術(shù)技能，以提高移植成功率。

本研究顯示大鼠卵巢組織自體移植到腎被膜下和頸部皮下后，都可見到竇卵泡形成并且可以獲得GV期卵子；兩組間卵泡存活率差異無(wú)顯著性意義。這提示，新鮮大鼠卵巢組織進(jìn)行腎被膜下及頸部皮下這兩個(gè)部位移植效果可能相差不大。但是由于時(shí)間限制本研究只進(jìn)行到觀察卵泡及GV期卵子階段，并沒有進(jìn)行授精及優(yōu)胚率的計(jì)算。

綜上所述，大鼠去勢(shì)后進(jìn)行卵巢組織自體移植，腎被膜下比頸部皮下手術(shù)更加快捷有效，兩種部位移植后獲得相似的卵泡生存率。移植后如何獲得成熟卵子及移植是否影響胚胎的發(fā)育有待進(jìn)一步研究。

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Effect of two methods of transplantation research on auto-transplantation of ovarian tissue in rats

XU Ke1,2，WANG Xing-ling1，LIU Yan-li1

(1.ReproductiveMedicalCancer,theThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China；2.TheThirdAffiliatedHospitalofTCM,Zhengzhou450008,China)

[Abstract]Objective To investigate the influence of two transplantation methods on auto-transplantation of mouse ovarian tissue in SD mice. Methods According to the operation methods，the mice were divided into three groups： kindey capsule transplantation group， neck subcutaneous transplantation group and control group(n=20). The operation time were recorded after operation.Vaginal smears to observe estrus cycle in mice，two weeks later giving HMG to stimulate ovarian oviposit， after 48 h recycling ovarian tissue and HE dyeing to observe histological changes and the follicle survival rate was recorded.Results Significantly lengthened operation time was observed in neck subcutaneous transplantation group than kindey capsule transplantation group[(20.7±2.8)min vs. (18.8±2.5)min，P<0.05]. Kindey capsule transplantation group and neck subcutaneous transplantation group mice appeared estrus rate were 81.25% and 61.11% respectively(P<0.05)，there was no difference between the two transplantation groups back estrus days. The recovery rate of kindey capsule group was 81.3% after giving HMG， and the recovery rate of the neck subcutaneous group was 55.6%(P>0.05).The follicle survival rates in the two transplantation groups were significantly less than control group (P<0.05)，while there was no significant difference between the two transplantation groups (P>0.05).Conclusion Kindey capsule is more suitable for auto-transplantation of mouse ovarian tissue than neck subcutaneous， auto-transplantation of mouse ovarian tissue kindey capsule can get better results.

[Key words]ovarian tissue；subcutaneous auto-transplantation；castration；mice；estrus cycle

作者簡(jiǎn)介:許 珂(1980-), 女,河南南陽(yáng)人，主治醫(yī)師。 E-mail: 2545016081@qq.com 通信作者:王興玲,教授。 E-mail: wangxl208@126.com

doi:論著10.11724/jdmu.2016.01.06

[中圖分類號(hào)]R711.75

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

文章編號(hào)：1671-7295(2016)01-0024-04

(收稿日期:2015-07-03；修回日期：2016-01-07)