張　宏，王　文，田　甜，趙茜茜，馬興聰，閆婉君，高曉燕，張淑群

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，陜西西安　710004)

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◇臨床研究◇

Ezrin在三陰性乳腺癌中的表達及意義

張宏，王文，田甜，趙茜茜，馬興聰，閆婉君，高曉燕，張淑群

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，陜西西安710004)

摘要：目的研究Ezrin在三陰性乳腺癌中的表達及意義。方法應(yīng)用免疫組化SP法測定24例三陰性乳腺癌、58例非三陰性乳腺癌及20例乳腺良性疾病組織中Ezrin的表達，比較各組Ezrin陽性表達率的差異，分析其與三陰性乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果Ezrin在三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌及乳腺良性疾病組織中的陽性表達率分別為75.00%、48.28%、15.00%，三者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。三陰性乳腺癌中Ezrin高表達與組織學分級和臨床TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、腫瘤大小及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論Ezrin在三陰性乳腺癌中高表達，提示其可以作為三陰性乳腺癌預(yù)后不良的一個重要指標。

關(guān)鍵詞：Ezrin；三陰性乳腺癌；免疫組化

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體2(Her-2)均為陰性的乳腺癌，約占全部乳腺癌的15%～20%，具有發(fā)病年齡早、侵襲性強、無病生存率低、病理惡性程度高、早期容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移、內(nèi)分泌治療及Her-2分子靶向治療無效等特點，嚴重威脅患者的身心健康，現(xiàn)已成為乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點[1-2]。Ezrin是ERM(ezrin-radixin-moesin)蛋白家族成員之一，是一種細胞骨架和細胞膜的連接蛋白，幾乎存在于任何細胞之中。近年研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin高表達與乳腺癌等多種惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ezrin可通過參與腫瘤細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、改變腫瘤細胞的極性及細胞遷移、調(diào)節(jié)腫瘤細胞間粘附及細胞與細胞外基質(zhì)粘附等多種途徑促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，是抗腫瘤藥物作用的重要潛在靶點[3-5]。Ezrin在三陰性乳腺癌中的表達及意義尚未見報道。本實驗通過測定三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌及乳腺良性疾病組織中Ezrin的陽性表達率，比較Ezrin在各組之間表達情況的差異，并分析其與三陰性乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，以期探討三陰性乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差的分子基礎(chǔ)，從而為三陰性乳腺癌的靶向治療提供新的靶點。

1材料與方法

1.1試劑及標本來源小鼠抗人Ezrin單克隆抗體(Thermo Fisher公司)；SP免疫組化染色試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)。收集2014年3月至2015年3月西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科收治的82例乳腺癌患者，均為浸潤性導(dǎo)管癌。用免疫組化檢測ER、PR及Her-2的表達情況，只有ER、PR及Her-2均不表達時定義為三陰性乳腺癌，有任何一個或幾個表達則定義為非三陰性乳腺癌。82例中三陰性乳腺癌患者24例，非三陰性乳腺癌患者58例。三陰性乳腺癌患者年齡30～56歲，平均為(43.94±1.67)歲，臨床分期包括：Ⅰ期6例、Ⅱ期6例、Ⅲ期12例。58名非三陰性乳腺癌患者年齡38～77歲，平均(50.78±2.01)歲，臨床分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期29例、Ⅲ期17例。另有乳腺良性疾病患者20例，包括9例乳腺囊性增生及11例乳腺纖維腺瘤。所有患者均為女性，全部經(jīng)過病理學確診且術(shù)前均未行放化療。

1.2免疫組織化學SP法檢測Ezrin表達標本經(jīng)400 mL/L甲醛(100 mL/L福爾馬林)固定，常規(guī)制作5 μm 厚連續(xù)切片。1張切片HE染色并進行復(fù)診。

另采用免疫組織化學SP法檢測Ezrin表達。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水后，置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中，熱平臺修復(fù)抗原15 min，冷卻至室溫。30 mL/L H2O2室溫孵育20 min后，PBS洗5 min×3次。正常山羊血清封閉20 min后，傾去不洗，滴加一抗(小鼠抗人Ezrin單克隆抗體，稀釋比1∶100)，4 ℃放置過夜。PBS洗5 min×3次后，滴加二抗，室溫放置20 min；磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次后，滴加SP，37 ℃孵育10 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3評定標準Ezrin的陽性染色主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒。采用雙盲法，在鏡下隨意選取5個視野，按染色深淺程度及陽性細胞百分比，并參考李瓊等[6]的分級標準將Ezrin的表達情況分為3個等級：(-)，無表達；(+)，陽性細胞百分比<50%或染色程度較淺；()，陽性細胞百分比≥50%或染色程度較深。(-)及(+)判為Ezrin表達陰性，而()判為Ezrin表達陽性。

1.4三陰性乳腺癌中Ezrin陽性表達與患者臨床病理特征的關(guān)系將三陰性乳腺癌患者分別按年齡、腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、組織學分級、臨床TNM分期進行分組，比較各組間Ezrin表達情況的差異。

1.5統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學分析，各組實驗結(jié)果的比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1乳腺組織中Ezrin的表達結(jié)果Ezrin陽性染色即鏡下觀察到的棕黃色顆粒，多數(shù)彌漫性表達在細胞質(zhì)中，少部分表達在細胞膜上，而細胞核膜上均未見到陽性染色物(圖1)。

圖1Ezrin在不同乳腺組織中的表達

Fig.1 The expression of Ezrin in different breast tissues (×400)

A：三陰性乳腺癌組織；B：非三陰性乳腺癌組織；C：乳腺良性疾病組織。

Ezrin在乳腺良性疾病組織中的陽性表達率為15.00%(3/20)，在非三陰性乳腺癌組織中為48.28%(28/58)，在三陰性乳腺癌組織中為75.00%(18/24)。三組的結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=15.736，P<0.001)。三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌中Ezrin的表達高于乳腺良性疾病，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=6.876，P=0.009；χ2=15.742，P<0.001)；三陰性乳腺癌組的Ezrin陽性表達率高于非三陰性乳腺癌組，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=4.923，P=0.027，表1)。

表1乳腺良性疾病組織、非三陰性乳腺癌組織和三陰性乳腺癌組織中Ezrin的表達情況

Tab.1The expression of Ezrin in breast benign disease tissue, non-triple negative breast cancer tissue and triple negative breast cancer tissue

組別例數(shù)Ezrin陰性陽性陽性率(%)乳腺良性疾病2017315.00非三陰性乳腺癌58302849.28*三陰性乳腺癌2461875.00*#

與乳腺良性疾病組比較，*P<0.05；與非三陰性乳腺癌組比較，

#P<0.05。

2.2三陰性乳腺癌中Ezrin陽性表達與患者臨床病理特征的關(guān)系三陰性乳腺癌患者年齡≤50歲組的Ezrin陽性表達率為72.73%(8/11)，>50歲組為76.92%(10/13)，差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)；原發(fā)腫瘤最大直徑≤2cm組和>2cm組的Ezrin陽性表達率分別為66.67%(6/9)、80.00%(12/15)，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.635)；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組Ezrin陽性表達率為87.50%(7/8)，較陰性組的68.75%(11/16)增高，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.621)，這可能與樣本數(shù)量較小有關(guān)；Ezrin陽性表達率隨著組織學分級的增加而逐漸升高，組織學分級G1級組的Ezrin陽性表達率為33.33%(2/6)，G2級組為75.00%(3/4)，G3級組為92.86%(13/14)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016)；臨床TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組的Ezrin陽性表達率為50.00%(6/12)，Ⅲ期組為100.00%(12/12)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.014，表2)。

3討論

三陰性乳腺癌是乳腺癌的一種特殊類型，與非三陰性乳腺癌相比，有其特有的生物學特征，預(yù)后差，多發(fā)于絕經(jīng)前女性，多數(shù)有乳腺癌家族史，異質(zhì)性和組織學分級較高，部分與遺傳基因BRCA1相關(guān)，多數(shù)具有基底細胞樣表型的特點。病理類型以浸潤性導(dǎo)管癌為主，較早發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，容易發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移，表達P-cadherin、EGFR、CK 5/6、P53較多而表達AR、E-cadherin、Cyclin D較少，5年生存率和總生存率均低于非三陰性乳腺癌[7-8]。因此，三陰性乳腺癌已經(jīng)成為目前乳腺癌治療領(lǐng)域亟待解決的難題。

表2Ezrin表達與三陰性乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.2The expression of Ezrin and its relationship with clinicopathologic features of patients with triple negative breast cancer

臨床病理特征例數(shù)Ezrin表達(例數(shù))陰性陽性陽性率(%)P值年齡(歲)1.000 ≤50113872.73 >501331076.92腫瘤大小(cm)0.635 ≤293666.67 >21531280.00淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.621 陰性1651168.75 陽性81787.50組織學分級0.016 高分化(G1)64233.33 中分化(G2)41375.00 低分化(G3)1411392.86臨床TNM分期0.014 Ⅰ～Ⅱ期126650.00 Ⅲ期12012100.00

Ezrin蛋白的分子質(zhì)量約為82 ku，由定位于人染色體6q25.2-q26的Villin2基因編碼，其結(jié)構(gòu)主要包括3個部分：N-端是具有高度同源性的FERM功能域，可與多種細胞表面粘附分子(CD44、c-Met、ICAM1、ICAM2等)相結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞與細胞或細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附，從而影響腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；中間是連接N-端和C-端的α螺旋結(jié)構(gòu)；C-端是可與細胞骨架肌動蛋白相連的F-肌動蛋白結(jié)合區(qū)，該區(qū)內(nèi)含有Ezrin的磷酸化活化位點。方軍[9]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中Ezrin的表達顯著高于乳腺良性疾病組織，其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小等無關(guān)。王明喜等[10]的研究也證實，乳腺癌中Ezrin表達上調(diào)，其高表達在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。MAK等[11]研究發(fā)現(xiàn)Src通過調(diào)節(jié)Ezrin蛋白第477位上的酪氨酸殘基的磷酸化調(diào)控乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。ELLIOTT等[12]用鼠乳腺癌細胞系A(chǔ)C2M2進行移植實驗，發(fā)現(xiàn)將表達野生型Ezrin的細胞移植到同基因型小鼠的乳房脂肪墊中可引起肺轉(zhuǎn)移，而Ezrin活性被抑制的細胞移植后則沒有觀察到肺轉(zhuǎn)移，說明Ezrin在乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中是必不可少的。LI等[13]發(fā)現(xiàn)使用RNA干擾技術(shù)使Ezrin基因表達沉默后可有效降低乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，證實Ezrin參與了乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。

本研究結(jié)果顯示，Ezrin在三陰性乳腺癌組織與非三陰性乳腺癌組織中的表達差異具有統(tǒng)計學意義，Ezrin在三陰性乳腺癌組織中高表達提示Ezrin可作為三陰性乳腺癌預(yù)后不良的指標之一。Ezrin在三陰性乳腺癌中的表達與組織學分級以及臨床TNM分期有關(guān)。馬力[14]的研究表明，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Ezrin的表達水平隨著組織學分級、臨床TNM分期的增加而逐漸升高，其表達與組織學分級和臨床TNM分期呈正相關(guān)。但是本研究中Ezrin的表達與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況無關(guān)，可能是由于樣本量較少的緣故。Ezrin在三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌中的表達均顯著高于乳腺良性疾病，這與GSCHWANTLER-KAULICH等[15]的研究結(jié)果一致。

Ezrin在三陰性乳腺癌中高表達可能是三陰性乳腺癌侵襲性強、早期容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的原因之一，但是其在三陰性乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的具體作用及詳細機制尚不清楚，其表達上調(diào)的機制也有待進一步研究。檢測Ezrin在三陰性乳腺癌患者中的表達情況可能有助于判斷其預(yù)后，并為其早期診斷及靶向治療提供一定的依據(jù)。相信隨著大量相關(guān)實驗的開展與研究，Ezrin有望為三陰性乳腺癌的診治提供新的靶點。

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(編輯國榮)

收稿日期：2015-12-31修回日期：2016-03-11

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81274136)

通訊作者：張淑群. E-mail: zhangshuqun1971@aliyun.com

中圖分類號：R737.9

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604021

The expression and significance of Ezrin in human triple negative breast cancer

ZHANG Hong, WANG Wen, TIAN Tian, ZHAO Xi-xi, MA Xing-cong,YAN Wan-jun, GAO Xiao-yan, ZHANG Shu-qun

(Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the expression and significance of Ezrin in triple negative breast cancer tissues. MethodsWe selected 102 cases, including 24 ones of triple negative breast cancer, 58 ones of non-triple negative breast cancer, and 20 of benign breast disease. The expression of Ezrin in all the specimens was detected by SP immunohistochemistry. We observed whether there was any difference between the positive expression rates of Ezrin in the three groups. We also analyzed the correlation between Ezrin expression and clinicopathologic parameters of triple negative breast cancer. ResultsThe positive expression rate of Ezrin in groups of triple negative breast cancer, non-triple negative breast cancer, and benign breast disease was 15.00%, 48.28% and 75.00%, respectively. The difference between the three groups differed significantly (P<0.01). The high expression of Ezrin in triple negative breast cancer had relationship with histological grading and clinical TNM staging (P<0.05), but not with patients’ age, tumor size, or axillary lymph node metastasis (P>0.05). ConclusionEzrin is highly expressed in triple negative breast cancer tissues; therefore, it can be used as an important indicator of poor prognosis of triple negative breast cancer.

KEY WORDS:Ezrin; triple negative breast cancer; immunohistochemistry

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81274136)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.1736.018.html(2016-06-08)