李劍，曲芃芃

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HPV E6/E7 mRNA與HPV DNA檢測在宮頸癌早期篩查中的臨床價值

李劍1，2，曲芃芃2

摘要：目的分析不同病變程度的宮頸病變患者高危型人乳頭瘤病毒（HPV）DNA和高危型HPV E6/E7 mRNA表達陽性率及拷貝數(shù)的差異，評估兩者對宮頸癌早期篩查的臨床價值。方法收集天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院2014年因?qū)m頸疾患行陰道鏡下宮頸活檢的154例患者資料和因其他良性婦科疾患行全子宮切除術(shù)的32例患者資料（對照組），154例根據(jù)宮頸活檢病理結(jié)果分為宮頸上皮內(nèi)瘤變低級別組（51例）、高級別組（71例）及宮頸浸潤癌組（32例）。應用雜交捕獲技術(shù)（HC2）HPV DNA檢測和熒光定量雜交捕獲技術(shù)HPV E6/E7 mRNA檢測進行定量測定，并對全部患者的術(shù)后或?qū)m頸活檢石蠟標本進行E6/E7蛋白免疫組化檢測。結(jié)果HC2 HPV DNA檢測和HPV E6/E7 mRNA檢測顯示對照組陽性率低于各級別病變組（P＜0.05），高危型HPV E6/E7 mRNA檢測的拷貝數(shù)隨著病變級別的加重而明顯增高，而HC2 HPV DNA檢測的拷貝數(shù)不隨病變級別的加重而改變。高級別組及宮頸浸潤癌組患者中，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測拷貝數(shù)＞10 000的患者比例明顯增多。免疫組化結(jié)果顯示對照組E6/E7陽性率低于各級別病變組，高級別組、宮頸浸潤癌組的E6/E7陽性率高于低級別組（均P＜0.05）。結(jié)論HPV E6/E7 mRNA的表達及拷貝數(shù)的測定與宮頸病變程度密切相關(guān)，是宮頸癌早期篩查的有效措施之一，HPV DNA檢測結(jié)果為陰性時，其排除疾病意義更高，而mRNA檢測結(jié)果為陽性時，其預測疾病發(fā)生及進展的價值更好，兩者結(jié)合使用有利于綜合評價發(fā)生宮頸病變的風險。

關(guān)鍵詞：宮頸腫瘤；乳頭瘤病毒；HPV E6/E7 mRNA檢測；HPV DNA檢測；宮頸癌早期篩查

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有23萬女性死于宮頸癌［1］。目前普遍認為高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續(xù)感染是發(fā)展成宮頸癌的主要因素，而基因E6、E7 是HPV致癌機制研究中的重點［2-3］。目前美國食品和藥品管理局（FDA）已批準了Aptima HPV作為唯一針對高危型HPV E6/E7 mRNA的檢測方法，屬于新一代的檢測技術(shù)，但在國內(nèi)尚處于起步階段。本研究應用雜交捕獲技術(shù)（HC2）HPV DNA檢測和熒光定量雜交捕獲技術(shù)HPV E6/E7 mRNA檢測對186例患者宮頸脫落細胞標本進行測定，并對全部患者術(shù)后或?qū)m頸活檢石蠟標本進行E6/E7蛋白免疫組化檢測，探討HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA檢測在宮頸癌早期篩查中的臨床價值及意義。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2014年2月—11月我院門診因?qū)m頸疾患行陰道鏡下宮頸活檢的154例患者資料，根據(jù)病理活檢結(jié)果分為3組，包括低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變患者（低級別組）51例，年齡22～64歲，平均（40.6±9.3）歲；高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變患者（高級別組）71例，年齡25～62歲，平均（41.9±9.0）歲；宮頸浸潤癌患者（宮頸浸潤癌組）32例，F(xiàn)IGO分期為Ⅰa1～Ⅲb期，年齡32～64歲，平均（42.3±9.1）歲；因其他良性婦科疾患行全子宮切除術(shù)的32例患者作為對照組，年齡35～68歲，平均（42.8±8.9）歲。4組患者年齡差異無統(tǒng)計學意義（F=1.317，P＞0.05）。4組既往均無盆腔放療史、急性生殖道炎癥及宮頸物理治療史。

1.2試劑及設(shè)備高危型HPV E6/E7 mRNA檢測：96孔檢測板及宮頸穩(wěn)態(tài)試劑盒購自河南科帝亞生物技術(shù)有限公司。HPV DNA檢測：檢測板及采樣工具包購自美國Digene公司。兩實驗均使用美國Diacarta公司臺式冷光儀及QS071型恒溫箱；DAB顯色試劑盒及免疫組織化學SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗HPV16/18 E6單抗購自美國Miltenyi-Biotec公司；HPV16 E7鼠抗人單克隆抗體購自美國Invitrogen公司。

1.3方法

1.3.1高危型HPV E6/E7 mRNA檢測標本采集：使用新柏氏液基細胞學（TCT）檢測專用刷插入患者宮頸管旋轉(zhuǎn)8～10周，收集宮頸口及宮頸管脫落的上皮細胞，將刷頭置入CytoRich保存液瓶中待檢。實驗步驟：將待檢標本液經(jīng)2次水平離心（3 000 r/min）5 min后，倒掉上清液，加入裂解液及蛋白酶K，放入恒溫箱65℃約1.5 h，中間每隔30 min取出標本振蕩搖勻，加入96孔檢測板，同時設(shè)立空白對照2孔及陽性質(zhì)控2孔。通過2種捕獲探針捕獲目的mRNA，經(jīng)3級信號放大，添加底物及底物催化劑，使連接了堿性磷酸酶的標記探針雜交結(jié)合放大分子，添加底物，再使其與底物結(jié)合，從而產(chǎn)生化學發(fā)光信號，信號強度與mRNA數(shù)量呈正相關(guān)，經(jīng)冷光儀檢測出目的mRNA數(shù)量，以拷貝數(shù)為單位計算?？截悢?shù)＞0為陽性；拷貝數(shù)＜4 000為低危風險；4 000～10 000為中危風險；拷貝數(shù)＞10 000為高危風險。

1.3.2HPV DNA檢測標本采集：使用采樣工具包檢測專用刷插入患者宮頸管旋轉(zhuǎn)8～10周，收集宮頸口及宮頸管脫落的上皮細胞，將刷頭置入CytoRich保存液瓶中待檢。將待檢標本首先溶解，解鏈和變性核酸，釋放HPV DNA單鏈；再將全長病毒RNA探針與HPV病毒靶DNA結(jié)合，形成RNA/ DNA復合物，該復合物被包被在微孔板上的抗體捕獲，抗體特異性結(jié)合RNA/DNA復合物；最后用二抗結(jié)合捕獲后的復合物，二抗偶聯(lián)有堿性磷酸酶，加入堿性磷酸酶的底物，產(chǎn)生化學發(fā)光信號，經(jīng)冷光儀檢測出目的DNA的數(shù)量，以拷貝數(shù)為單位計算，拷貝數(shù)＞0者為陽性。

1.3.3E6/E7蛋白免疫組織化學SP法檢測對全部186例患者術(shù)后或?qū)m頸活檢石蠟標本進行切片，本實驗使用的SP法，采用生物素標記的二抗與鏈霉素抗生素蛋白鏈接的過氧化物酶及底物色素相混合，測定細胞或組織中的抗原。實驗結(jié)果以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性判斷標準。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，組間多重比較采用Dunnett's T3法。計數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較用Χ2檢驗，多組比較檢驗水準α=0.05，進一步4組兩兩比較時檢驗水準進行Bonferroni校正α′=0.008 3。

2　結(jié)果

2.1高危型HPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)果低級別組、高級別組和宮頸浸潤癌組HPV E6/E7 mRNA陽性率及拷貝數(shù)均高于對照組，且后2組HPV E6/E7 mRNA陽性率（90.1%、93.8%）高于低級別組（72.5%）和對照組（21.9%）。HPV E6/E7 mRNA檢測的拷貝數(shù)隨病變級別的加重而增多，高級別組與宮頸浸潤癌組mRNA拷貝數(shù)多＞10 000，對照組和低級別組mRNA拷貝數(shù)多＜4 000。見表1。

2.2HPV DNA檢測結(jié)果低級別組、高級別組和宮頸浸潤癌組DNA陽性率及拷貝數(shù)均高于對照組，但3個病變組之間差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

Tab.1　Results of HPV E6/E7 mRNA test in four groups of patients表1　4組患者HPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)果

Tab.2　Results of HPV DNA test in four groups of patients表2　4組患者HPV DNA檢測結(jié)果

2.3HPV病毒E6/E7蛋白的表達結(jié)果4組患者E6/E7陽性率差異有統(tǒng)計學意義。低級別組、高級別組與宮頸浸潤癌組均高于對照組，且后2組蛋白陽性率均高于低級別組，但該2組差異無統(tǒng)計學意義，見表3，圖1、2。

Tab.3　Results of HPV E6/E7 protein expression in four groups of patients表3　4組患者HPV病毒E6/E7蛋白表達結(jié)果　例（%）

Fig.1　Expression of E6/E7 by immunohistochemistry（SP，×100）圖1　E6/E7免疫組織化學染色結(jié)果（SP，×100）

3　討論

3.1高危型HPV E6/E7 mRNA檢測的研究現(xiàn)狀研究預計宮頸癌的死亡人數(shù)將在近十年內(nèi)上升25%，發(fā)達國家因?qū)m頸癌篩查防治措施逐步完善，發(fā)病率已逐年減低，但大多數(shù)發(fā)展中國家的宮頸癌發(fā)病率卻呈上升趨勢［3］。目前普遍認為高危型HPV的持續(xù)感染是發(fā)展成宮頸癌的主要因素［4］，而早期基因E6、E7是HPV致癌機制研究中的重點。當其表達失去抑制后將逐步導致宮頸癌。E6結(jié)合并滅活腫瘤抑制因子P53，E7結(jié)合并降解抑制蛋白pRb，最終導致細胞無限分裂而不發(fā)生凋亡［5］。早診斷、早治療是提高子宮頸癌患者生存率及改善其生存質(zhì)量的關(guān)鍵。目前美國FDA相繼批準了4個宮頸癌相關(guān)高危型HPV檢測，前3種屬于第一代的高危型HPV DNA檢測方法，而AptimaHPV屬新一代唯一針對高危型HPV E6/E7 mRNA的檢測方法。本研究顯示，低級別組與高級別組及宮頸浸潤癌組HPV DNA陽性率相似，且HPV DNA檢測的拷貝數(shù)并未隨著病變級別的加重而增加；而高危型HPV E6/E7 mRNA檢測中，低級別組陽性率低于高級別組及宮頸浸潤癌組，且高危型HPV E6/E7 mRNA檢測的拷貝數(shù)隨著病變級別的加重而明顯增多。提示HPV E6/E7 mRNA檢測可能敏感度較高。

3.2高危型HPV E6/E7 mRNA檢測的臨床價值高危型HPV E6/E7 mRNA檢測中危風險以上（拷貝數(shù)＞4 000）的陽性表達提示：宮頸上皮細胞有高危型HPV病毒的感染，癌基因E6/E7處于復制活動期，病變處于轉(zhuǎn)化活躍期，患者癌變風險逐漸增加；在病毒感染的早期，病毒基因在細胞內(nèi)為游離狀態(tài)，此時E6/E7基因處于靜默期，不表達或低表達mRNA，一過性感染大多數(shù)處于這個階段［6］。有研究指出HPV DNA檢測敏感度約為95%，而mRNA檢測的敏感度為75%～91%；但特異度mRNA檢測為56%～97%，而DNA僅為40%～47%［7-8］。HPV DNA檢測陽性似然比為1.1～1.9，而mRNA檢測陽性似然比為2.0～5.8。也就是說，當mRNA檢測陽性時，患者有宮頸病變的可能性更高。HPV DNA檢測陰性似然比為0.03～0.20，mRNA檢測陰性似然比為0.16～0.29，提示DNA陰性時，患者無宮頸病變的可能性更大?？傊?，宮頸癌篩查時，HPV DNA檢測結(jié)果為陰性時排除疾患的價值更高，而mRNA檢測結(jié)果為陽性時預測疾患的價值更好［9］。評價一個好的篩查方法，雖然難以要求其確診功能，但其應該既不遺漏真正患病的患者，也能較好地排除非患病人群，不給隨訪者帶來較大的心理負擔。根據(jù)美國癌癥協(xié)會（American Cancer Society，ACS）、美國陰道鏡和宮頸病理學會（American Society for Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP）發(fā)布的宮頸癌篩查指南，不建議對30歲以下人群采取常規(guī)HPV DNA檢測，因約70%～80%的女性在一生中有可能感染HPV，90%感染者可在8～24個月內(nèi)自然清除，只有少數(shù)持續(xù)性、高危型HPV感染有可能導致宮頸病變或?qū)m頸癌［10-11］。由于宮頸癌患者有年輕化趨勢，而HPV E6/ E7 mRNA檢測具有良好的陽性預測功能，應用該指標進行30歲以下人群的篩查，找出高危人群，對宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)具有一定的臨床意義［12］。聯(lián)合細胞學檢測，有效分流意義未明的不典型鱗狀細胞（ASCUS）及低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）者，可以減輕患者的心理負擔，節(jié)約寶貴的醫(yī)療資源，具有極大的社會經(jīng)濟學效益。此外，對于宮頸上皮內(nèi)瘤變患者治療后的隨訪，利用HPV E6/E7 mRNA檢測可有效評估復發(fā)風險。

總之，對于HPV DNA檢測已日趨成熟，HPV E6/E7 mRNA檢測方興未艾，兩者結(jié)合使用有利于綜合評估患者發(fā)生宮頸病變的風險。

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（2015-11-25收稿2015-12-06修回）

（本文編輯李鵬）

The clinical value of HPV E6/E7 mRNA and HPV DNA in early screening of cervical cancer

LI Jian1，2，QU Pengpeng2
1 Graduate School of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics Corresponding AuthorE-mail：18622059808@163.com

Abstract：ObjectiveTo analyze the differences of positive detection rate and copy number of human papillomavirus （HPV）DNA and E6/E7 mRNA between different grades of cervical lesions，and evaluate their clinical values in early screening of cervical cancer.MethodsThe cervical exfoliated cell samples from 154 women undergoing biopsy examination and 32 objects undergoing hysterectomy（control group）were collected in Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics in 2014.According to the pathological results of cervical biopsy，154 samples were divided into low-grade squamous intraepithelial lesion group（LSIL，n=51），high-grade squamous intraepithelial lesion group（HSIL，n=71），and squamous cell carcinoma group（SCC，n=32）.HPV DNA was tested with hybrid capture technology，and E6/E7 mRNA was detected with fluorescence quantitative hybridization.Immunohistochemistry was performed by detecting E6/E7 protein in all patients after surgery or cervical biopsy.ResultsCombined results of HPV DNA and E6/E7 mRNA demonstrated that the positive detection rate was significantly lower in control group than that of all levels of lesion groups（P＜0.05）.The copy number of high risk HPV E6/E7 mRNA was significantly increased with the aggravation of lesions（P＜0.05），whereas no difference was found in that of HPV DNA.Compared with the normal control and low-grade squamous intraepithelial lesion group，cervical cancer patients with mRNA copies＞10 000 E6/E7 were significantly increased in high-grade squamous intraepithelial lesion group.Immunohistochemical results showed that the positive detection rate of E6/E7 was significantly lower in control group than that of all levels of lesion groups（P＜0.05）.The positive rate of E6/E7 was significantly higher in the high-grade squamous intraepithelial lesion group than that of low-grade group（P＜0.05）.ConclusionHPV infection is closely related tocervical abnormalities，which is one of effective measures for early screening of cervical cancer.The negative result of HPV DNA is very helpful to exclude the cervical abnormality，whereas the positive detection of mRNA has great value in predicting the disease.Combined results of positive detection and copy number make a comprehensive evaluation for the risk of cervical lesions.

Key words：uterine cervical neoplasms；human papillomavirus；HPV E6/E7 mRNA detection；HPV DNA detection；early cervical cancer screening

中圖分類號：R737.33

文獻標志碼：A

DOI：10.11985/20150342

基金項目：天津市科技計劃項目（09ZCZDSF03900）

作者單位：1天津醫(yī)科大學研究生院（郵編300070）；2天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院

作者簡介：李劍（1978），女，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤臨床研究

通訊作者E-mail：18622059808@163.com